背景介紹

     在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中，外部刺激通過(guò)背根神經(jīng)節(jié)（Dorsal root ganglion，DRG）的假單極感覺(jué)神經(jīng)元（Pseudo-unipolar sensory neurons）傳遞到脊髓（Spinal cord）中。小的DRG可以通過(guò)無(wú)髓鞘的軸突（Un myelinated axons，C-fibers）和薄髓鞘的軸突（thinly myelinated axons，Aδ-fibers）傳遞從神經(jīng)末梢（Peripheral nerve terminals）發(fā)生的疼痛感、溫度和機(jī)械感受信號(hào)至脊髓的I-II層。大的DRG則通過(guò)厚髓鞘的軸突（thickly myelinated axons，Aβ-fibers）傳遞機(jī)械感受信號(hào)和本體感覺(jué)信號(hào)至脊髓的III-V層。DRG在信號(hào)傳遞的過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。盡管在之前文獻(xiàn)中，已經(jīng)有通過(guò)芯片和RNA測(cè)序的手段對(duì)DRG的基因表達(dá)有所研究，并且鑒定到了一些神經(jīng)調(diào)節(jié)物質(zhì)（Neuromodulators）的表達(dá)，如：尿鈉排泄肽B（Natriuretic peptide B，NPB）和Na+，K+-ATPase（NKA），但卻并沒(méi)有對(duì)單個(gè)神經(jīng)元提供全方位的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)情況的介紹。

     最近，有多個(gè)工作已經(jīng)對(duì)DRG神經(jīng)元的轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行了分析，如：TRPV1世系和Nav1.8通道表達(dá)DRG神經(jīng)元的RNA-seq。在單細(xì)胞測(cè)序（Single-cell RNA-seq）方面，Chiu等鑒定到了6個(gè)DRG神經(jīng)元的亞家族。相比于普通的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，單細(xì)胞測(cè)序可以使人們對(duì)單一細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序有更深入的了解。在神經(jīng)生物學(xué)的研究中，由于神經(jīng)元相對(duì)其他組織細(xì)胞而言具有高度的異質(zhì)性（Heterogeneity），因此普通轉(zhuǎn)錄組測(cè)序不能夠滿足人們對(duì)神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平的研究。單細(xì)胞測(cè)序可以逐個(gè)對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的分析，因此在神經(jīng)生物學(xué)的研究中具有廣泛的應(yīng)用。Usockin等按照傳統(tǒng)模式，對(duì)小鼠DRG進(jìn)行的低覆蓋度的單細(xì)胞測(cè)序?qū)�DRG分為了11個(gè)不同類(lèi)型。雖然這些工作對(duì)感覺(jué)神經(jīng)元的研究有重要意義，但是卻并不全面。

    上海生命科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所張旭院士聯(lián)合生物芯片上海國(guó)家工程研究中心、上海生命科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞研究所、上�？萍即髮W(xué)以及徐匯區(qū)中心醫(yī)院利用高覆蓋度的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)以及體內(nèi)膜片鉗（in vivo patch clamp）技術(shù)，按照轉(zhuǎn)錄模式、分子標(biāo)記以及功能注釋將小鼠DRG分為了10個(gè)大類(lèi)和14個(gè)小類(lèi)，還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的軀體感覺(jué)受體種類(lèi)。作者還認(rèn)為目前對(duì)分子功能以及信號(hào)網(wǎng)絡(luò)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可以部分的預(yù)測(cè)不同神經(jīng)元的功能。該成果已經(jīng)發(fā)表在了2015年12月的國(guó)際著名期刊Cell Reasarch（影響因子11.981）上。該研究中單細(xì)胞測(cè)序服務(wù)由上海伯豪生物技術(shù)有限公司提供。

1. 神經(jīng)元樣本和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)控

    研究人員首先利用融合IB4的CGRP，NF200熒光標(biāo)記物對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行免疫染色（Immunostaining）。結(jié)果表明，～35%的神經(jīng)元能被IB4染色，～41.2%被CGRP染色，～46.4%被NF200染色（圖1A）。大約20%被IB4染色的神經(jīng)元能夠表達(dá)CGRP，然而只有5.6%表達(dá)NF200。大約28%被CGRP染色的神經(jīng)元表達(dá)NF200。極少數(shù)可以同時(shí)被三個(gè)染色。

    為了提高對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞分類(lèi)的效率，研究人員設(shè)計(jì)了一個(gè)專(zhuān)門(mén)針對(duì)DRG分類(lèi)的方法。首先，DRG細(xì)胞被從小鼠體內(nèi)分離出后再利用IB4對(duì)其染色（圖1B）。顯微鏡下，那些周?chē)鷽](méi)有衛(wèi)星細(xì)胞的被選擇用來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。測(cè)序文庫(kù)一共來(lái)源于19個(gè)小鼠的203個(gè)神經(jīng)元。

    為了獲得可靠的單神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，研究人員首先通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)測(cè)序的深度和檢測(cè)基因數(shù)量進(jìn)行分析，并且確認(rèn)了在維持測(cè)序質(zhì)量的前提下，每個(gè)樣本至少3000萬(wàn)的reads作為合理的最小測(cè)序量。最終，研究人員每個(gè)樣本的平均測(cè)序量達(dá)到了5820萬(wàn)（2960萬(wàn)－1.064億）（圖1C）。檢測(cè)到的基因數(shù)量范圍在7972-13960個(gè)之間（圖1D）。為了評(píng)估測(cè)序深度和基因數(shù)量之間的關(guān)系，研究人員還對(duì)其中6個(gè)文庫(kù)進(jìn)行了重新測(cè)序，平均測(cè)序量達(dá)到了1.81億個(gè)reads。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和深度測(cè)序相比，同一文庫(kù)的相似度為99.8%（圖1E）。

     最后，為了確認(rèn)RNA-seq的質(zhì)量，研究人員將同一文庫(kù)的cDNA等量分成兩份再一次進(jìn)行了RNA-seq，兩次測(cè)序的匹配度達(dá)到了99.4%。

2. 基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)鑒定基因模塊（Gene module）

    研究人員對(duì)197個(gè)單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（Weighted gene co-expression network analysis, WGCNA）常被用于對(duì)有關(guān)聯(lián)的基因進(jìn)行模塊分類(lèi)。由于在該分析模式下，同一個(gè)細(xì)胞簇中有著高度關(guān)聯(lián)的基因，因此這對(duì)細(xì)胞分類(lèi)頗為有用。使用WGCNA方法，研究人員在2043個(gè)差異表達(dá)基因中鑒定到了12個(gè)基因模塊（圖1G）。

      原位雜交（In situ hybridization, ISH)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了該結(jié)果的可靠性（圖1H）。

3. 基于神經(jīng)元大小的分級(jí)成簇分析（Neuron size-based hierarchical clustering）揭示了10個(gè)細(xì)胞簇

    研究人員還將197個(gè)神經(jīng)元中1745個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行基本的分析來(lái)對(duì)神經(jīng)簇進(jìn)行歸類(lèi)（圖2A），一共將其分為10個(gè)種類(lèi)，分別為C1-C10�；�于對(duì)1745個(gè)差異基因的細(xì)胞－細(xì)胞關(guān)聯(lián)矩陣（cell-cell correlation matrix）分析，C9神經(jīng)元被認(rèn)為高度關(guān)聯(lián)(value of Spearman correlation (VSC): 0.780±0.007) 。 

圖1:神經(jīng)元樣本，RNA測(cè)序以及基因分類(lèi)

4. 14個(gè)神經(jīng)元亞簇和雜交狀態(tài)

      根據(jù)簇的分類(lèi)，C1，C2，C4，C5，C，C8以及C9還可以被分為兩個(gè)亞簇，總共14個(gè)亞簇（圖2A，3A）。以C4為例，C401表達(dá)Mrgpra3基因，而C4-2同時(shí)表達(dá)Mrgpra3基因與Mrgprb4基因。單細(xì)胞定量PCR以及原位雜交實(shí)驗(yàn)同樣確認(rèn)了C4-2的存在（圖3B-D）。Mrgpra3基因與Mrgprb4基因盡管同在C4-2中被檢測(cè)到，但共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)卻沒(méi)有任何交集（圖3E）。

5. 神經(jīng)元簇中的差異基因

    研究人員使用了Fisher檢測(cè)來(lái)鑒定神經(jīng)元簇和亞簇中的差異基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C1包含了高表達(dá)的Tac1和Calca基因，然而C2中Nppb有高表達(dá)。C1與C2的比較中發(fā)現(xiàn)了152個(gè)差異表達(dá)的基因，其中83個(gè)在C1中高表達(dá)。另外，研究人員還對(duì)其余的神經(jīng)元簇和亞簇進(jìn)行了差異基因的分析。

6. 神經(jīng)元簇的標(biāo)志物

    一個(gè)合格的標(biāo)志基因的先決條件需要具備可選擇性，高表達(dá)以及可實(shí)驗(yàn)性。Gal，Nppb，Th以及Mrgpra3被認(rèn)為是C1，C2，C3和C4的標(biāo)志物（圖4A）。每個(gè)簇可以有多個(gè)標(biāo)志物，如Nts，Il31ra以及Htr1f同時(shí)作為C2的標(biāo)志物（圖4B），Cadps2，Baiap2l1和Necab2同時(shí)作為C9的標(biāo)志物（圖4C）等等。原位雜交實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了該結(jié)果的準(zhǔn)確性（圖4F，G）。

7. 神經(jīng)元簇的功能表型

   研究人員為了確認(rèn)鑒定的14個(gè)神經(jīng)元亞簇具有不同的生物學(xué)功能，還對(duì)其進(jìn)行了各個(gè)條件的無(wú)差異性分析（圖5），確認(rèn)了不同神經(jīng)元亞簇在接受信號(hào)過(guò)程中表現(xiàn)出不同的表型具備不同的功能。

原文出處
Li CL, Li KC, Wu D, Chen Y, Luo H, Zhao JR, Wang SS, Sun MM, Lu YJ, Zhong YQ, Hu XY, Hou R, Zhou BB, Bao L5, Xiao HS, Zhang X. Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity.Cell Res. 2015 Dec 22.