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環(huán)狀RACE試劑盒（PCR法）
英文名稱：Circular RACE Kit (PCR Method)總訪問：436
國產(chǎn)/進(jìn)口：國產(chǎn)半年訪問：27
產(chǎn)地/品牌：天凈沙產(chǎn)品類別：分子生物學(xué)試劑
規(guī)       格：10次 最后更新：2025-3-5
貨       號：221071
CAS   號：
參考報價：2100-2500
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  • 產(chǎn)品介紹
  • 公司簡介
產(chǎn)品及特點(diǎn) 確定基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和終止位點(diǎn)是研究基因結(jié)構(gòu)和功能的最重要工作之一，最通用的方法是Frohman發(fā)明Rapid Amplification of cDNA Ends。其用于確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的方法叫5′ RACE法，用于確定轉(zhuǎn)錄終點(diǎn)的方法叫3′ RACE法。它們是通過PCR快速克隆cDNA末端，在不建立cDNA文庫的前提下，利用已知cDNA序列設(shè)計引物，通過向mRNA兩端延伸和擴(kuò)增獲得兩個末端的序列。但是要確定RNA兩端的序列需要做兩次RACE，為克服此缺點(diǎn)，本公司開發(fā)了環(huán)狀RACE試劑盒，其原理如下：
 
本產(chǎn)品具有下列特點(diǎn)：
  • 即開即用，客戶只需要準(zhǔn)備總RNA（或mRNA）和專一性引物，不需要單獨(dú)準(zhǔn)備其他試劑。
  • 一次實驗可以同時獲得mRNA兩端的序列。
  • 通過適配子進(jìn)行cDNA自連，不但效率高，而且測序時知曉哪里是自連位點(diǎn)。
  • 本產(chǎn)品足夠10次環(huán)狀RACE實驗（10次雙鏈cDNA合成反應(yīng)，20次環(huán)化反應(yīng)，100次PCR反應(yīng)）。
  • 起始材料為純化后的mRNA，用于需要準(zhǔn)備兩套PCR引物。
  • 本產(chǎn)品只能用于科研。
  
規(guī)格及成分 本產(chǎn)品采用10孔盒加大塑料袋包裝
成分 編號 規(guī)格 包裝
環(huán)狀RACE溶液A 221071a 20 μL 0.5 mL綠蓋管
環(huán)狀RACE溶液B 221071b 10 μL 0.5 mL白蓋管
環(huán)狀RACE溶液C 221071c 20 μL 0.5 mL紅蓋管
環(huán)狀RACE溶液D 221071d 160 μL 0.5 mL白蓋管
環(huán)狀RACE溶液E 221071e 40 μL 0.5 mL黃蓋管
環(huán)狀RACE溶液F 221071f 10 μL 0.5 mL紅蓋管
微量核酸沉淀劑 220313 1 mL 1.5 mL白蓋管
環(huán)狀RACE溶液G 221071g 200 μL 0.5 mL黃蓋管
環(huán)狀RACE溶液H 221071h 10 μL 0.5 mL紅蓋管
2×染料法qPCR MasterMix 990408 0.5 mL 0.5 mL本色蓋
超純水 210806 1 mL 1.5 mL藍(lán)蓋管
使用手冊 221071sc 1份 無
 
 		  
運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸、-20℃保存、有效期一年。  
自備試劑 目標(biāo)RNA、基因?qū)Ｒ恍砸镏辽?條、75%乙醇。  
使用方法 一：引物的設(shè)計和準(zhǔn)備工作
1. 利用已知道序列的區(qū)域設(shè)計基因?qū)Ｒ恍砸飪商祝较蛳蛲猓ǜＲ?guī)PCR向反），其中在距離5’端10-30個堿基設(shè)計的基因?qū)Ｒ恍砸锝?yw2，其下游100多個堿基設(shè)計的另外一對引物叫5yw1，兩者同向，均向外擴(kuò)增。在距離3’端10-30個堿基設(shè)計的基因?qū)Ｒ恍砸锝?yw2，其下游100多個堿基設(shè)計的另外一對引物叫3yw1，兩者同向，均向外擴(kuò)增。Tm最好為58℃。引物合成后需加超純水溶解，使其濃度為10 μM，然后1：1混合后，放冰上待用。沒有用完的放-20℃保存。5yw1和3yw1混合得PCR引物混合液，5yw2和3yw2混合得巢式PCR引物混合液。
二：逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA
2. 在一個PCR管中，加入以下組分：
成分 用量
自備樣品mRNA或RNA 6 μL（0.5-2μg）
環(huán)狀RACE溶液A 2 μL
環(huán)狀RACE溶液B 1 μL
70℃ 2分鐘后室溫放置2分鐘，短暫離心
加入環(huán)狀RACE溶液C 1 μL
輕柔吹打混勻后42℃保溫90分鐘
超純水 49 μL
環(huán)狀RACE溶液D 16 μL
環(huán)狀RACE溶液E 4 μL
共79μL。吹打混勻后，短暫離心，16℃保溫2小時，加入環(huán)狀RACE溶液F 1μL，總體系80μL，16℃保溫5分鐘，70℃保溫5分鐘
 
三：沉淀法回收cDNA
3. 加入160μL微量核酸沉淀劑，顛倒10次混勻后，15000g離心10分鐘后小心棄上清。
4. 加入1mL自備的75%乙醇，顛倒10次混勻，15000g離心3分鐘后小心棄上清。
5. 再短暫離心10秒，小心吸棄殘留上清（約50μL）。
6. 加入40μL超純水溶解DNA沉淀，所得溶液即為待環(huán)化cDNA溶液。將此溶液分成兩個管，每管20μL，一管標(biāo)為環(huán)化樣本，另一管標(biāo)為非環(huán)化對照。
四：cDNA的環(huán)化
7. 在上述兩管中（各含有20 μL cDNA溶液）加入以下組分：
成分 環(huán)化樣本管 非環(huán)化對照管
超純水 68 μL 70 μL
環(huán)狀RACE溶液G 10 μL 10 μL
環(huán)狀RACE溶液H 2 μL 不加
 
8. 16℃保溫16小時，65℃10分鐘，最后得環(huán)化樣本原液和非環(huán)化樣本原液。
五：第一輪PCR擴(kuò)增
9. 在3個PCR管中，分別加入以下組分：
成分 1號
環(huán)化模板		 2號
非環(huán)化樣模板		 3號
無模板
超純水 6 μL  6 μL 8 μL
自備PCR引物混合液 2 μL 2 μL 2 μL
上步所得環(huán)化樣本原液 2 μL - -
上步所得非環(huán)化樣本原液 - 2 μL -
2×染料法qPCR  MasterMix 10 μL 10 μL 10 μL
合計 20 μL 20 μL 20 μL
 
10. 按下列條件進(jìn)行qPCR（注：應(yīng)根據(jù)自備引物的Tm值選擇適當(dāng)?shù)耐嘶饻囟�，下面的參�?shù)僅僅供參考）。
第1步：94℃ 5分，48-52℃ 2分，72℃ 4分，設(shè)置一次循環(huán)
第2步：94℃ 40秒，52-60℃ 1分，72℃ 3分，設(shè)置40次循環(huán)，在復(fù)性步驟采集SYBR通道的熒光信號。
11. 如果SYBR熒光信號呈現(xiàn)倒S型，則在其剛達(dá)到平臺時終止PCR，即使循環(huán)數(shù)還沒到設(shè)置的40次循環(huán)。如果SYBR通道沒有熒光信號或到40次循環(huán)時熒光信號還沒有到達(dá)平臺，則按設(shè)置的40次循環(huán)進(jìn)行PCR，按時結(jié)束。
12. PCR結(jié)束后，電泳檢測。如果有清晰的、RACE專一的擴(kuò)增產(chǎn)物（只有1號管有，而2號和3號管沒有的DNA條帶），則直接膠回收、克隆、選10個轉(zhuǎn)化子進(jìn)行質(zhì)粒測序。如果有多條清晰的、RACE專一的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，則優(yōu)先選擇分子量最大的條帶。如果沒有RACE專一的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，則再進(jìn)入下步。
六：巢式PCR
13. 在3個PCR管中設(shè)置如下反應(yīng)：
成分 4號管 5號管 6號管
超純水 6 μL 6 μL 6 μL
巢式PCR引物混合液 2 μL 2 μL 2 μL
第一輪PCR 1號管反應(yīng)液 2 μL     
第一輪PCR 2號管反應(yīng)液   2 μL  
第一輪PCR 3號管反應(yīng)液     2 μL
2×染料法qPCR MasterMix 10 μL 10 μL 10 μL
合計 20 μL 20 μL 20 μL
 
14. 按下列參數(shù)進(jìn)行PCR：94℃ 2分鐘，（94℃ 30秒，50℃ 30秒，68℃ 2分）40個循環(huán)，在復(fù)性步驟采集SYBR通道的熒光信號。
15. 如果SYBR熒光信號呈現(xiàn)倒S型，則在其剛達(dá)到平臺時終止PCR，即使循環(huán)數(shù)還沒到設(shè)置的40次循環(huán)。如果SYBR通道沒有熒光信號或到40次循環(huán)時還沒有到達(dá)平臺，則按設(shè)置的40次循環(huán)進(jìn)行PCR，按時結(jié)束。
16. PCR結(jié)束后，電泳檢測。如果有清晰的、RACE專一的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶（只有4號管有，而5號和6號管沒有的DNA條帶），則直接膠回收、克隆、選10個轉(zhuǎn)化子進(jìn)行質(zhì)粒測序。如果有多條清晰的、RACE專一的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，則優(yōu)先選擇分子量最大的條帶。如果沒有RACE專一的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，則需要將第一輪PCR得到的3管PCR產(chǎn)物分別稀釋10倍，100倍，1000倍后，再取2 μL為模板進(jìn)行巢式PCR，共9個擴(kuò)增。然后尋找RACE專一的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶。
17. 得到專一條帶克隆和測序結(jié)果后，再進(jìn)入下一步。
七：序列分析
18. 測序得到的結(jié)果同時包含了目標(biāo)RNA 的3端序列、逆轉(zhuǎn)錄引物序列和目標(biāo)RNA 的5端序列，故需要根據(jù)已知的逆轉(zhuǎn)錄引物序列和它們的相對位置關(guān)系，先將三者分開。它們的相對位置關(guān)系如下：
 
         RNA 3端            逆轉(zhuǎn)錄引物互補(bǔ)鏈（含polyA序列）               環(huán)化接口   RNA 5端
5 NNNNNNNNNAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTTGAGCTCGAGTCCTCGTCACTCTGCTCACTGG  NNNNNNNNNNNNNNN 3
3 NNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTCGAACTCGAGCTCAGGAGCAGTGAGACGAGTGACC  NNNNNNNNNNNNNNN 5
                                  逆轉(zhuǎn)錄引物（含polyT）
 
19. 上圖逆轉(zhuǎn)錄引物互補(bǔ)序列（含polyA）左側(cè)的區(qū)域到PCR F引物結(jié)合位點(diǎn)之間的這段區(qū)域為目標(biāo)RNA的3端序列。不排除逆轉(zhuǎn)錄引物跟RNA中間的富含A的區(qū)域結(jié)合，這樣得到的序列不一定是RNA的3端，但這種情況只占少數(shù)。由于是對多個克隆進(jìn)行測序，因此大多數(shù)序列還是目標(biāo)RNA的3端序列。
20. 上圖斷裂處為環(huán)化位點(diǎn)，該位點(diǎn)右側(cè)直到PCR R引物結(jié)合位點(diǎn)之間的這段區(qū)域為目標(biāo)RNA 5端的序列。
21. 將每個克隆得到的目標(biāo)RNA 3端和5端序列跟目標(biāo)RNA的已知序列（設(shè)計引物所使用的序列）、RACE引物序列、RNA對應(yīng)的基因組DNA序列（如果有的話）等一起進(jìn)行多重比對，確定它們彼此的相對位置和同源序列。
22. 如果有必要，可以用得到的新的RNA序列再設(shè)計新的RACE引物，繼續(xù)用本試劑盒克隆未知區(qū)域的序列。		  
關(guān)聯(lián)產(chǎn)品 5′RACE試劑盒  


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 天凈沙可以定做基因：比如抗藥性基因、轉(zhuǎn)基因元件等特定基因的檢測；定做種屬檢測試劑盒：動植物病原微生物（科研用）、中藥材、微生物分型等。  定做試劑盒包括： 普通PCR、染料法熒光定量PCR、探針法熒光定量PCR和LAMP。更多產(chǎn)品請訪問我們的網(wǎng)站 http://www.tjs.bio

 

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