BTP-N端測序可以解決的生物學(xué)問題

蛋白表達(dá)產(chǎn)物的驗(yàn)證：重組蛋白插入位點(diǎn)和表達(dá)順序是否正確；蛋白品質(zhì)量控制；

細(xì)胞株建立和發(fā)酵過程中蛋白產(chǎn)物的驗(yàn)證：驗(yàn)證細(xì)胞株建立和發(fā)酵過程中蛋白產(chǎn)物N端甲硫氨酸和信號(hào)肽是否正確處理；

蛋白降解/酶切分析：對(duì)降解/酶切形成的新蛋白片段N端進(jìn)行分析，確定斷裂/酶切位點(diǎn)；

De-novo測序：對(duì)于蛋白數(shù)據(jù)庫中不存在的全新蛋白序列進(jìn)行分析。

百泰派克公司也建立了以先進(jìn)的LC-MS/MS技術(shù)進(jìn)行N-端測序的平臺(tái)，可以測出封閉和修飾的蛋白質(zhì)末端，與Edman降解法形成互補(bǔ)，保證N端測序服務(wù)的順利進(jìn)行。

關(guān)于樣品

PVDF膜類樣品的準(zhǔn)備過程

1.樣品電泳和電轉(zhuǎn)

對(duì)蛋白樣品進(jìn)行1D或者2D跑膠

將蛋白膠上的樣品轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；注意：千萬不要使用硝酸纖維素膜（Nitrocellulose membranes）

在此過程中請(qǐng)佩戴手套和頭套，避免自身角蛋白對(duì)測序結(jié)果的影響

2.PVDF膜的染色

染色過程中可以使用考馬斯亮藍(lán)或者立春紅對(duì)PVDF膜進(jìn)行染色；注意：千萬不要使用銀染的方法進(jìn)行染色

染色完成之后，可以使用雙蒸水對(duì)PVDF膜進(jìn)行清洗

如果轉(zhuǎn)膜的緩沖液中含有甘氨酸，需要對(duì)PVDF膜進(jìn)行多次沖洗，以避免甘氨酸對(duì)后續(xù)分析的影響

更詳細(xì)的樣品準(zhǔn)備步驟與，見Edman測序樣品準(zhǔn)備Protocol（下劃線部分加入超鏈接）

3.靶蛋白條帶獲取

PVDF膜染色后，靶條帶清晰可見，用潔凈的解剖刀將靶蛋白條帶切下

在蛋白量允許的情況下，可以準(zhǔn)備2-3條靶條帶以增加靶蛋白的量

4.樣品運(yùn)輸

密閉包裝后，冰袋運(yùn)輸即可

溶液樣品的準(zhǔn)備過程

1.蛋白的純度和用量

樣品純度要＞90%

Buffer中不要使用表面活性劑，并盡可能降低溶液的鹽濃度

Tris, glycine, guanidine, glycerol, sucrose, ethanolamine, SDS, Triton, X-100, Tween和其他的去垢劑, ammonium sulfate 和其他的銨鹽均會(huì)對(duì)后續(xù)的氨基酸鑒定產(chǎn)生影響，在樣品準(zhǔn)備過程中要避免使用

樣品準(zhǔn)備過程全程佩戴口罩和頭套，避免角蛋白的影響

樣品需要量在1-10ug

2.蛋白樣品的運(yùn)輸

液體樣品推薦干冰運(yùn)輸

液體樣品也可以在冷凍抽干或者真空抽干后，冰袋運(yùn)輸

一站式服務(wù)

您只需下單-寄送樣品

百泰派克一站式服務(wù)完成：樣品處理-上機(jī)分析-數(shù)據(jù)分析-項(xiàng)目報(bào)告

表達(dá)純化后的蛋白產(chǎn)物，特別是蛋白品的分析過程中，需要對(duì)蛋白的末端進(jìn)行驗(yàn)證，以保證表達(dá)純化產(chǎn)物的N端和C端序列準(zhǔn)確。Edman降解法是蛋白的N端序列分析中非常成熟的方法之一，得到廣泛應(yīng)用。百泰派克公司采用島津公司最新推出的 edman測序系統(tǒng)，為官大科研工作者和科研客戶提供純化后蛋白產(chǎn)物、蛋白品、抗體以及蛋白疫苗的N端測序服務(wù)。采用我們的測序系統(tǒng)，可以測定N端30個(gè)氨基酸的序列信息。采用特定的蛋白上樣系統(tǒng)，我們最多可以測定N端的60-70個(gè)氨基酸。

如下圖所示，每一個(gè)Edman測序循環(huán)包括3步：第一步是在堿性條件下，PITC與蛋白N端的游離氨基結(jié)合；第二步是在酸性溶液中，N端殘基被切除；第三步是PITC結(jié)合的殘基轉(zhuǎn)化成為更為穩(wěn)定的PTH殘基，經(jīng)過在線的HPLC分析，根據(jù)洗脫時(shí)間最終確定氨基酸種類。

Edman測序反應(yīng)過程

蛋白樣品首先進(jìn)行SDS-PAGE的分離，保證樣品的純度滿足測序的要求；隨后將SDS-PAGE上的蛋白樣品轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；經(jīng)過染色確定把蛋白條帶并切出；Edman測序儀對(duì)得到的PVDF膜上的蛋白樣品進(jìn)行分析。

Edman測序?qū)嶒?yàn)流程圖

中/英文項(xiàng)目報(bào)告

在最終的技術(shù)報(bào)告中，百泰會(huì)為您提供詳細(xì)的中英文雙語版技術(shù)報(bào)告，報(bào)告包括：

1, 實(shí)驗(yàn)步驟（中英文）

2, 相關(guān)的質(zhì)譜參數(shù)（中英文）

3, 鑒定的氨基酸的詳細(xì)信息

4, 質(zhì)譜圖片

5, 原始數(shù)據(jù)

研究案例

如下圖所示，通過Edman測序，可提供鑒定的氨基酸的詳細(xì)信息。