為了一定程度提高工作效率以及確保員工安全，研究機(jī)構(gòu)會限制在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)工作的時間，因此在顯微觀察中實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞成像自動化以及簡化任務(wù)比以往任何時候都更為重要。

那么顯微鏡如何在顯微觀察中實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞成像自動化以及簡化任務(wù)，從而讓其在研究中實(shí)現(xiàn)高效成像呢？

標(biāo)本在溫暖、穩(wěn)定的環(huán)境中保持健康狀態(tài)。

活細(xì)胞成像過程中最大挑戰(zhàn)之一就是如何在溫暖舒適的培養(yǎng)箱之外確保樣品健康并能夠在顯微鏡下實(shí)現(xiàn)正常觀察。

盡管存在難度，但可以利用能夠?yàn)榧?xì)胞提供穩(wěn)定溫度、濕度和CO ₂密度的顯微鏡專用載物臺上式培養(yǎng)箱或封閉式培養(yǎng)箱確保標(biāo)本環(huán)境盡可能適宜。

另外記得加熱物鏡，否則其作為寒冷的接觸源可能會損害樣品的健康。微孔板外圍區(qū)域可能存在比中心區(qū)域更高的環(huán)境波動風(fēng)險，因此務(wù)必使用中心區(qū)域的孔，并避免使用邊緣附近的孔影響穩(wěn)定性。比如說，如使用的是96孔板（12×8孔），那么就只使用中心的60孔（10×6孔）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

通過創(chuàng)造穩(wěn)定的環(huán)境溫度改善聚焦效果。

另一個需要考慮的因素是室內(nèi)溫度，這是因?yàn)榧?xì)微的變化也會影響到成像性能。

顯微鏡的環(huán)境溫度穩(wěn)定性對于活細(xì)胞的高倍率觀察尤其重要。由于高數(shù)值孔徑觀察的景深較淺，因此即使溫度變化造成很小的Z漂移，系統(tǒng)也可能會因此離焦。

為了優(yōu)化環(huán)境條件，開始實(shí)驗(yàn)之前請確保打開您的空調(diào)并保持室溫穩(wěn)定。另外為了提高穩(wěn)定性，還要避免氣流從空調(diào)直接吹向顯微鏡。

通過精確設(shè)置焦點(diǎn)和校正環(huán)提高圖像質(zhì)量。

解決諸如Z漂移之類時間性波動的另一種方法是開始活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)前盡可能精確設(shè)置焦點(diǎn)和環(huán)校正。

研究人員往往只會細(xì)心調(diào)整焦點(diǎn)，而忽略了校正環(huán)。然而，校正環(huán)能夠顯著改善圖像的質(zhì)量，在進(jìn)行深層組織觀察或使用高數(shù)值孔徑物鏡時尤其如此。

校正環(huán)的理想位置取決于諸如樣品折射率、觀察平面深度和蓋玻片厚度等許多因素。即便大多數(shù)蓋玻片和玻璃底培養(yǎng)皿的厚度只有170 μm（＃1.5），其仍然會導(dǎo)致波動，并且更重要的是，我們不能以塑料培養(yǎng)皿推測這些值。

因此，務(wù)必通過檢查圖像對比度的方式對校正環(huán)進(jìn)行精確調(diào)整，尤其是在使用塑料微孔板或培養(yǎng)皿時更要如此。

通常情況下，環(huán)校正必須要在現(xiàn)場進(jìn)行調(diào)整。對于諸如使用多光子顯微鏡進(jìn)行深層觀察等需要主動調(diào)整環(huán)校正的實(shí)驗(yàn)，這可能意味著需要在實(shí)驗(yàn)室中花費(fèi)更多的時間。不過我們可以選擇使用電動校正環(huán)自動執(zhí)行這些調(diào)整。

使用專用聚焦模塊讓樣品保持聚焦。

可是如果發(fā)生Z漂移怎么辦？

即使完成上述所有操作，您的圖像也可能無法始終保持對焦。畢竟，很多因素都會造成Z漂移。其既可能因諸如添加試劑等主動和有益改變所致，也可能由于有人在室內(nèi)行走或環(huán)境溫度變化造成的物理振動引起。

盡管大多數(shù)電動顯微鏡均具備基于圖像對比度的自動對焦功能，但仍然有其局限性：

• 調(diào)整范圍有限
• 基于對比度聚焦的激發(fā)光會造成光毒性

確保在活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)過程保持對焦的一種方法是使用專用聚焦模塊，比如TruFocus基于近紅外（NIR）激光的Z漂移補(bǔ)償器。近紅外光還可在長時間觀察過程中盡可能地降低光毒性以及成像波長的串?dāng)_。

該模塊的單次自動對焦（AF）模式可預(yù)防不必要的照明，而連續(xù)自動對焦模式可用于實(shí)時觀察或快速現(xiàn)象的連續(xù)圖像采集。

高效的工作始終是我們追求的目標(biāo)，所以顯微鏡的一些使用技巧可以幫助我們保持高效多產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)更長時間的活細(xì)胞成像，使得科研工作更上一層樓。