印莉萍¹    上官宇²    許越^{2 *}

 

1.    首都師范大學生命科學學院， 北京 100037; 2.Younger USA Company, P.O. Box 37106, Raleigh, NC 27627 USA;)

 

摘要  各種分子和離子進出細胞的過程對于維持植物體自身的活性至關(guān)重要.非損傷性掃描離子選擇電極技術(shù)(Scanning Ion-selective Electrode Technique,SIET)在不接觸被測生物樣品－即在保持被測生物樣品完整和近乎實際生理環(huán)境的狀態(tài)下，獲得進出樣品的各種分子和離子的信息.該技術(shù)不僅能夠測量離子及分子靜止狀態(tài)下的絕對濃度，而且還可以測量它們進出生物樣品的運動速率及運動方向.SIET可以圍繞被測的單個或多個細胞、組織甚至器官進行靈活、方便而準確的立體測量并獲得被測物體周圍的離子或分子的三維立體數(shù)據(jù).目前，SIET不但可以分別測量H⁺,Ca²⁺,K⁺,Al³⁺,Cd²⁺,Cl^-和O₂，CO₂，NO及溫度等參數(shù)，而且可以同時采集多種離子及參數(shù)，為獲得生物樣品內(nèi)外分子或離子運動的有關(guān)信息提供了良好的實驗平臺.

關(guān)鍵詞 非損傷性電生理技術(shù) 離子選擇性電極 離子跨膜轉(zhuǎn)運 SIET

 對于跨膜的離子分子活性和轉(zhuǎn)運機制的研究始終是植物分子生理學研究的一個重要方面.特別是在基因組研究后期所面臨的一個挑戰(zhàn)就是如何理解和確認那些未知的或者人工表達的蛋白質(zhì)功能，特別是細胞質(zhì)膜上的離子的轉(zhuǎn)運載體，以及由這些蛋白質(zhì)所產(chǎn)生的眾多信息是如何被細胞正確地整合到一起的.非損傷性掃描離子選擇電極技術(shù)(Scanning IonSelective Electrode Technique, SIET)作為一個綜合性較強的電生理技術(shù)成為迎接這一挑戰(zhàn)的理想工具.

SIET 技術(shù)的核心是離子和分子選擇性微電極(以下簡稱：離子電極)(圖1)，由Kühtreiber和 Jaffe^[1]設計的一套由計算機控制的自動定位測量系統(tǒng)演變發(fā)展而成.在計算機控制、信號放大和三維測量方面做了較大的改進^[2].由于SIET能夠以非損傷的方式測量到進出生物材料的離子以及分子的運動速率，并隨著離子/分子電極種類的不斷增多以及電子線路技術(shù)和計算機硬件軟件的逐步完善，SIET逐漸被應用到基礎生物學、生理學、神經(jīng)生物學、空間生物學、臨床醫(yī)學、基礎醫(yī)學、病理學、毒理學、營養(yǎng)分子生理學、農(nóng)林學及藥物機理研究等領(lǐng)域^[3，4].

盡管人們通過膜電壓的測量，如膜片鉗技術(shù)^[5，6]，及與顯微技術(shù)相結(jié)合的熒光染料技術(shù)，獲得了一些有關(guān)離子分布和運動的情況，但是，SIET技術(shù)作為對上述幾項技術(shù)的重要補充，并以其特有的時間和空間分辨率，為鑒定或驗證某些生物膜轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的功能提供了非常有力的工具.在這篇綜述里，我們將介紹SIET的基本原理、方法及其在高等植物細胞研究中的應用.

圖1 離子選擇性電極和SIET的時間和空間分辨率分布

(a)Ca²⁺微電極的顯微照片，由液體離子交換劑(LIX)和電解質(zhì)組成；(b)圖中A表示通過染料標記或膜片鉗等局部研究方法的時空分辨率；B表示整體組織研究過程中通過較慢的化學痕量方法的時空分辨率；而SIET作為一個開放式的實驗平臺，較好地填補了較慢的化學痕量方法與較快的染料標記或膜片鉗等方法兩者之間的技術(shù)空白.

　

1 SIET 原理

1.1物理學及數(shù)學基礎

物質(zhì)在液體環(huán)境中有從高濃度到低濃度擴散的趨勢.對于帶電粒子而言，還有從高電化學電勢到低的電化學電勢運動的趨勢.如果，離子電極的移動距離dx在幾十微米以下，生物材料實驗證明，影響帶電粒子運動的電化學電勢的梯度可以忽略不計，那么，該離子的擴散運動速率可以通過Fick
第一擴散定律計算出來^[7] (圖2).

圖2以Ca²⁺濃度梯度和Ca²⁺微電極為例說明SIET的物理學及數(shù)學原理

 

離子選擇性電極由玻璃微電極、Ag/AgCl導線、電解質(zhì)(100mmol/L CaCl₂)及液態(tài)離子交換劑(LIX) 4部分組成.該電極在待測離子濃度梯度中以已知距離dx進行兩點測量，并分別獲得電壓V₁V₂.兩點間的濃度差dc則可以從V₁，V₂及已知的該電極的電壓/濃度校正曲線計算獲得.D是離子/分子特異的擴散常數(shù)(單位:cm^-2sec^-1)，將它們代入Fick的第一擴散定律公式： J_o= - D * dc/dx ，可獲得該離子的移動速率(單位：pmol cm^-2sec^-1)，即：每一秒鐘通過一個平方厘米的該離子/分子摩爾數(shù) .

液態(tài)離子交換劑是基于大型中性分子載體的一類有機化合物.目前可以購買得到一些常見的LIX.有些研究人員根據(jù)自己的需要還自行開發(fā)特殊的LIX，其他的種類還在不斷的開發(fā)中. 

1.2計算機技術(shù)及系統(tǒng)集成

SIET的誕生、發(fā)展與完善與計算機技術(shù)的不斷進步是密不可分的^[2,8] .盡管計算機需要同時控制三維運動系統(tǒng)、顯微成像系統(tǒng)和信號放大系統(tǒng)3個子系統(tǒng)，但由于離子選擇電極相對較低的時間分辨率要求，使得普通的個人計算機也可以完全勝任.這為SIET的普及和發(fā)展提供了很好的基礎. 

1.3 SIET的緩沖溶液

在使用SIET技術(shù)過程中，通常要在溶液中加入一些緩沖劑成份，如：MES，Tris或EDTA 等，用以穩(wěn)定被測離子以便離子選擇電極進行測量^[9-12] .然而，如果離子緩沖劑選擇或者使用不當，被測離子會與緩沖劑相互干擾，破壞被測離子的濃度梯度或者被大幅度壓縮，從而嚴重影響到SIET的應用效果.Kunkel 等通過系統(tǒng)的比較試驗，尋找到了一些最適合SIET
技術(shù)的溶液pH 緩沖劑及其使用方法，并以實際生物材料的研究證明通過使用這些方法可以將SIET測知離子流動速率的能力達到最大化^[13].因此，在SIET
實驗設計過程中，不但要考慮到測量溶液中各種成份對被測樣品生物活性的影響，還要充分考慮到緩沖劑成份對被測離子梯度的作用以及對液態(tài)離子交換劑（LIX）有無嚴重干擾.

1.4 SIET測量的空間幾何構(gòu)型

現(xiàn)有的1-2m微米直徑的離子電極，在電極距被測材料2-20
μm及dx在5-30μm的技術(shù)條件下，被測材料離子流動的空間幾何分布可以大致分為3類：點、平面及球體.在離子電極距被測材料小于5μm時，通常認為離子以平面方式運動.

值得一提的是，SIET是目前世界上惟一能夠按照研究人員的設定，以手動或編程的方式，從任意角度(相對于被測物體表面)用離子選擇電極對被測樣品進行測量的系統(tǒng).利用SIET靈活的空間測量方式的經(jīng)典的例子是對植物花粉管生長過程中，尖端Ca²⁺內(nèi)流的研究^[13]. Kunkel 等發(fā)現(xiàn)花粉管的生長與Ca²⁺內(nèi)流密切相關(guān)，只有在花粉管尖端迅速生長的部位才能檢測到Ca²⁺內(nèi)流速度.已經(jīng)伸長成熟的花粉管，幾乎檢測不到Ca²⁺內(nèi)流速率.人們不但能夠測量出Ca²⁺的內(nèi)流速率，而且還計算出該花粉管尖端一個圓盤式的結(jié)構(gòu)是Ca²⁺進入細胞的區(qū)域(Cardenas等 1999).

2 SIET 的應用

SIET誕生和發(fā)展是在植物學研究中實現(xiàn)的.這可能與植物細胞外的細胞壁對膜片鉗技術(shù)來講操作較為困難有關(guān).而利用SIET特有的非損傷性特點，可以在不對細胞、組織甚至器官造成任何損傷的情況下測知離子分子的轉(zhuǎn)運情況.正是意識到SIET的這一優(yōu)勢， Kochian 等在原有的Ca²⁺選擇微電極的基礎上，又相繼開發(fā)出了H⁺，K⁺，Al³⁺和Cd²⁺離子選擇性電極，將其應用于玉米根和植物毒理學的研究，并為這些電極在動物研究中的應用開辟了道路^[15-17].隨后，SIET技術(shù)被應用于整體根、根毛及花粉管的研究，并闡明了諸如鈣離子轉(zhuǎn)運與樣品內(nèi)部活動及生長的相關(guān)性^{[14，18-24]}.Messerli等應用SIET技術(shù)將脈動式的花粉管生長所體現(xiàn)的周期與離子流動速率表現(xiàn)出的頻率相互聯(lián)系起來. ^[25]

2.1離子與分子流動的同時測量證明了花粉管堿化帶的存在

Hepler等發(fā)現(xiàn)不斷生長的百合花粉管前端存在有一個堿化帶，之后他們提出該堿化帶可能是由于區(qū)域的線粒體的密集存在所致^[23].許越等應用SIET特有的雙電極同時測量功能，發(fā)現(xiàn)H⁺離子的外流和O₂分子的內(nèi)流是引起該堿化區(qū)的主要原因.花粉管的生長需要大量的能量，能量來源于線粒體的氧化磷酸化. O₂分子的內(nèi)流，伴隨H⁺離子的外流是形成能量的主要驅(qū)動力.也正是由于H⁺離子的外流造成了花粉管前端局部的堿化帶，從而證明Hepler等的假說是正確的(圖3)

圖3
H⁺和O₂ 流動速率的同時測量.

(a)顯微照片顯示金屬氧電極與玻璃H⁺電極同時測量百合花粉管生長過程中H⁺離子和O₂分子進出的變化；(b)在花粉管線粒體密集區(qū)域,
或稱固有堿化帶區(qū)域，同時存在的H⁺外流和O₂內(nèi)流現(xiàn)象.

 

 

2.2 SIET與熒光顯微技術(shù)結(jié)合證明磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)運蛋白與根毛發(fā)生有關(guān)

Vincent 等在鑒定出擬南芥磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)運蛋白家族 (PITPs)的一種成份AtSfh1p 之后，將顯微熒光技術(shù)與SIET
結(jié)合，從細胞的內(nèi)部和外部同時證明AtSfh1p 在根毛頂端生長過程中，具有調(diào)節(jié)細胞內(nèi)質(zhì)膜磷酸肌醇極性運輸、Ca²⁺信號傳遞和細胞骨架的功能.在植物細胞的極性生長機理研究方面向前推進了一步.

擬南芥缺失根毛突變體（AtSfh1p）不僅在根毛形態(tài)上有變化，不規(guī)則彎曲，失去重力極性；而且在Ca²⁺信號傳遞方面也有異常^[26].
利用Ca²⁺熒光顯微技術(shù)可測定細胞內(nèi)部Ca²⁺濃度梯度，而利用SIET可測得外部Ca²⁺流動情況.結(jié)果表明野生型的根毛只有在生長旺盛的頂尖區(qū)，Ca²⁺的內(nèi)流速度快，而突變株的根毛Ca²⁺流動的方向和大小明顯不同于野生型的根毛.非重力方向的根毛，四周表面都可以檢測到Ca²⁺的內(nèi)流，而且流速高于野生型的兩倍左右. ^[26]

 2.3 多離子電極的同時應用證明Ca²⁺及H⁺在植物感知重力變化中起作用

美國北卡羅來納州立大學植物系NSCORT
研究組受美國宇航局資助，研究植物感知重力的遺傳及生理機理，通過對重力非敏感的擬南芥突變體的研究，許越等發(fā)現(xiàn)植物根部在相對于地球重力不同的位置的情況下，其H⁺和Ca²⁺的流動在根部的不同位置呈現(xiàn)出不同的變化，顯示出及H⁺和Ca²⁺可能在植物感知重力變化的過程中扮演一定的角色(圖4)
^[6].

圖4
利用SIET 對重力非敏感植物突變體Ca²⁺及H⁺變化的同時測量.

(a)擬南芥突變體（ARG）及其野生型擬南芥（WS)；(b)ARG在重力變化刺激下的 Ca²⁺及H⁺變化與野生型對照有明顯的區(qū)別.

 

3 總結(jié)及展望

經(jīng)過多年的改進，SIET數(shù)據(jù)的生成、采集以及校準等方面不斷得到完善.特別是應用SIET
強大的三維立體測量方式，研究人員可以獲得其他電生理技術(shù)無法測到的被測樣品某些點的特異活性^[8，27-29]. SIET 是一個與膜片鉗^[30]無論在時間分辨率還是在空間分辨率上都不相同的技術(shù)，但兩者在應用過程中可以極好地相互補充.由于SIET
技術(shù)的出現(xiàn)，人們對于生物體特異離子轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的研究，在靈敏度上，時間和空間分辨率上已經(jīng)被大大地提高了，并已成熟地與細胞和分子生物學技術(shù)、其他電生理技術(shù)和顯微熒光成像技術(shù)配合使用.SIET
技術(shù)將在主動運輸離子或分子泵和協(xié)同運輸載體的研究方面發(fā)揮重大的作用.

分子生物學的進展使得我們能夠?qū)�質(zhì)膜轉(zhuǎn)運載體分子加以確定、克隆和進行可控制的表達.當這些轉(zhuǎn)運載體在分子水平方面通過在酵母、卵細胞等系統(tǒng)中的表達予以鑒定，或者某些細胞成份的物理結(jié)構(gòu)和生理功能闡明之后，SIET
技術(shù)的非損傷性，多離子/分子同時測量及靈活的空間測量方式將在細胞和組織水平上的功能鑒定方面發(fā)揮重要的、甚至是無法替代的作用.

　

致謝

感謝匡廷云院士在身患重病的情況下對SIET
技術(shù)的關(guān)心與支持.同時感謝美國Duke大學裴真明教授所作的有益的討論. 

 

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