Roche 454（GS FLX Titanium System）超高通量測序技術(shù)原理

2005年底，454公司推出了革命性的基于焦磷酸測序法的超高通量基因組測序系統(tǒng)——Genome Sequencer 20 System，被《Nature》雜志以里程碑事件報道，開創(chuàng)了邊合成邊測序的先河。2007年又推出了性能更優(yōu)的第二代基因組測序系統(tǒng)——Genome Sequencer FLX System。2008年10月，454推出了全新的GS FLX Titanium系列試劑和軟件，讓GS FLX的通量一下子提高了5倍，準確性和讀長也進一步提升。

GS FLX 測序原理

GS FLX系統(tǒng)的測序原理和GS 20一樣，也是一種依靠生物發(fā)光進行DNA序列分析的新技術(shù)；在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶和雙磷酸酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個dNTP的聚合與一次熒光信號釋放偶聯(lián)起來 (圖 1)。通過檢測熒光信號釋放的有無和強度，就可以達到實時測定DNA序列的目的。此技術(shù)不需要熒光標記的引物或核酸探針，也不需要進行電泳；具有分析結(jié)果快速、準確、靈敏度高和自動化的特點。

Roche GS FLX System是一種基于焦磷酸測序原理而建立起來的高通量基因組測序系統(tǒng)。在測序時，使用了一種叫做“Pico TiterPlate”（PTP）的平板，它含有160多萬個由光纖組成的孔，孔中載有化學發(fā)光反應所需的各種酶和底物。測序開始時，放置在四個單獨的試劑瓶里的四種堿基，依照T、A、C、G的順序依次循環(huán)進入PTP板，每次只進入一個堿基。如果發(fā)生堿基配對，就會釋放一個焦磷酸。這個焦磷酸在各種酶的作用下，經(jīng)過一個合成反應和一個化學發(fā)光反應，最終將熒光素氧化成氧化熒光素，同時釋放出光信號。此反應釋放出的光信號實時被儀器配置的高靈敏度CCD捕獲到。有一個堿基和測序模板進行配對，就會捕獲到一分子的光信號；由此一一對應，就可以準確、快速地確定待測模板的堿基序列。

圖1：GS FLX 高通量測序方法原理示意圖

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1、文庫制備：根據(jù)樣品的種類和實驗目的，將基因組DNA/cDNA片段化處理至400-800bp間，經(jīng)末端修復與特異性接頭連接等修飾后變性處理回收單鏈的DNA（sstDNA）；

2、Emulsion  PCR：特定比例的單鏈DNA文庫被固定在特別設(shè)計的DNA捕獲磁珠上，使大部分磁珠磁珠攜帶了一個獨特的單鏈DNA片斷。磁珠結(jié)合的文庫被擴增試劑乳化，形成油包水的混合物，每個獨特的片斷在自己的微反應器里進行獨立的擴增，而不受其他的競爭性或者污染性序列的影響。整個片段文庫的擴增平行進行。擴增后產(chǎn)生了幾百萬個相同的拷貝。隨后，乳液混合物被打破，擴增后仍結(jié)合在磁珠上的片段既可被回收純化用于后續(xù)的測序?qū)嶒灒?

3、測序反應：攜帶DNA的珠子與其他反應物混合物，隨后放入PTP板中進行后繼的測序。PTP孔的直徑（29um）只能容納一個珠子（20um）。然后將PTP板放置在GS FLX中，測序開始。每一個與模板鏈互補的核苷酸的添加都會產(chǎn)生化學發(fā)光的信號，并被CCD照相機所捕獲；

4、數(shù)據(jù)分析：GS FLX系統(tǒng)在10小時的運行當中可獲得100多萬個讀長，讀取超過4-6億個堿基信息，通過GS FLX系統(tǒng)提供兩種不同的生物信息學工具對測序數(shù)據(jù)進行分析。