無(wú)細(xì)胞百日咳生產(chǎn)工藝流程圖

瀏覽次數(shù)：4874　發(fā)布日期：2009-1-4　來(lái)源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

（僅供參考）

凍干菌種	號(hào)：58003（CS）參閱附錄1

無(wú)細(xì)菌百日咳菌懸液	含有20% 健康羊血的B-G 斜面，2支
	36℃培養(yǎng) 72hr
傳代培養(yǎng)	活性炭斜面，6個(gè)克氏瓶培養(yǎng)基：參閱附錄2
	36℃培養(yǎng) 48hr
搖床培養(yǎng)	培養(yǎng)基：參閱附錄3 裝有4000ml 滅菌培養(yǎng)基的10L瓶子，6個(gè) 1. 比濁 2.鏡檢 3.純菌
	表面通氣36℃培養(yǎng)20-24hr 120-160 rpm
發(fā)酵培養(yǎng) （300L）	培養(yǎng)基：同搖床培養(yǎng) 1. 血凝 2.鏡檢 3.純菌 4.比濁 5.pH
	表面通氣、攪拌，36℃培養(yǎng)30-36hr，340rpm
收獲和殺菌	上清培養(yǎng)液血凝滴度＞1:16，pH≤8.2 于培養(yǎng)液中加硫汞殺菌（1%→0.01%）

鹽析	發(fā)酵液中加入（NH4）2SO4 ，濃度為30.2%（w/v）
	2~8℃靜置，7天
離心收集沉淀
	4000rpm，4~8℃，6×1L，CR-7，4000rpm，30分離心30min
浸提	用0.05M PB 1M NaCl，0.01%硫柳汞緩沖液（參閱附錄4）浸提抗原
	2~8℃，4~6天，每天振搖2次，1hr/次
離心收集上清液	R9A，4×1L，8000rpm，40分
	8000rpm，4~8℃離心40min
鹽析	上清液中加入（NH4）SO4，濃度為20.2%（g/ml）
	2~8℃靜置7天
離心收集沉淀
	11000rpm，4~8℃離心400min R10A3 10000rpm 50分 6×500ml R12A6 12000rpm 35分 4×500ml
復(fù)溶
	攪拌3小時(shí)
透析	透析液：0.05M PB 1M NaCl 0.01% 硫柳汞收集上清液納氏試劑比色法：檢測(cè)殘余NH4+
	2~8℃
離心	收集上清液
	4~8℃ 離心5hr 16000rpm ；R13A，12800rpm，5小時(shí)30分或R19A，19000rpm，3小時(shí)28分；
蔗糖密度梯度離心	蔗糖濃度（參閱附錄5）：10%和30%，收集蔗糖濃度為5%~12%之間的抗原
	RPZ35T轉(zhuǎn)頭，25,000~30,000rpm，4~8℃ 離心18~20hr
抗原	用Lowrry法測(cè)定蛋白氮含量：≥50μgPH/ml
	2~8℃保存
稀釋至最終蛋白氮含量：50μgPH/ml	稀釋液：0.05M PB 1M NaCl 0.01% 硫柳汞

解毒	A：于抗原中加入戊二醛（2.5%→0.05%）溶液，20℃作用4hr B：然后用賴(lài)氨酸（參閱附錄6）（10%→0.2%）終止反應(yīng)，20℃作用2hr

透析	用0.85% NaCl 0.01%硫柳汞（參閱附錄7），透析直至戊二醛含量＜0.001%（比色法）

超聲勻化	2~8℃，透析7~14天
	2~8℃保存
原液	1. 蛋白氮含量測(cè)定 2. 鏡檢 3. 無(wú)菌試驗(yàn) 4. 不耐熱毒素試驗(yàn) 5. 特異性毒性試驗(yàn) 5.1 小鼠體重減輕試驗(yàn)：≤10BWDU/ml 5.2 小鼠白細(xì)胞毒性增加試驗(yàn)：≤0.5LPU/ml 5.3 小鼠組胺致敏毒性試驗(yàn)：≤0.8HUS/ml 6. 毒性逆轉(zhuǎn)試驗(yàn)：≤0.8HUS/ml 7. 保護(hù)性試驗(yàn) 8. 熱源試驗(yàn)
	2~8℃保存
DTaP配方	aP：18μgPH/ml D：25Lf/ml T：7Lf/ml Al（OH）3：1.3mg/ml（參閱附錄8）

成品	1. 鑒別試驗(yàn) 2.終容器檢查 3. 化學(xué)試驗(yàn) 4. 無(wú)菌試驗(yàn) 5. 特異性毒性試驗(yàn) 6. 保護(hù)性試驗(yàn) 7. 毒性逆轉(zhuǎn)試驗(yàn)

標(biāo)簽：無(wú)細(xì)胞百日咳制備

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