試劑和材料:
1. 2—4代的間質細胞;
2. HBSS/2FB;
3. Hoechst 33342染料,1mg/ml水溶;
4. 碘化丙啶(PI),2mg/ml水溶;
5. 維拉帕米,500μg/ml水溶;
6. DEME/2FB;
7. 胰蛋白酶/TrypLE:TrypLE Express或0.25%胰蛋白酶,溶于CMF-Saline G;
8. MoFlo(或與其類似的)高速細胞分選儀,具備350nm激發(fā)能力;
實驗方法:
1. 用PriCells原代細胞分離試劑盒2—4代的間質細胞;
2. 細胞計數,用DMEM/2FB將細胞稀釋至1×106/cm2個細胞/ml;
3. 加入5μg/ml Hoechst 33342染料,37℃,90min,每20min攪動一次;
4. 對照組細胞在加入Hoechst 33342染料前,先加入50μg/ml維拉帕米孵育20min;
5. 染色后,在4℃環(huán)境下用HBSS/2FB將細胞洗兩遍并離心,之后在冰上用冷HBSS/2FB重懸細胞;
6. 于分選前加入2μg/ml PI以鑒別無活性的細胞;
7. 無菌條件下分選細胞,高速細胞分選儀,用350nm激發(fā)。收集藍色(670nm)和紅色(450nm)熒光均減弱的細胞。邊群細胞通過上述步驟與死細胞和完全被染料標記的細胞分離開并被收集起來。對照組要確保用維拉帕米先行孵育后使邊群細胞消失;