用于生產(chǎn)MSCs的大鼠骨髓原代培養(yǎng)

試劑和材料：
1. 完全培養(yǎng)基（CCM）：α-MEM：α-低限量基礎(chǔ)培養(yǎng)基，含谷氨酰胺，無核苷酸或脫氧核苷酸；添加：20%附加L-谷氨酰胺 2mmol/L、經(jīng)FBS雜交瘤純化，非熱滅活、青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml。含0.2μg/ml兩性霉素B。過濾除菌。儲存于4℃，不超過2周；
2. PBSA；
3. 塑料組織培養(yǎng)Petri培養(yǎng)皿，15cm直徑；
4. 聚丙烯離心管，15ml和50ml；
5. 0.85%臺盼藍(lán)鹽溶液；
6. 改良的Neubauer血細(xì)胞計數(shù)器；
7. Eppendorf 5417C微量離心器或同等設(shè)備；

實驗方法：
1. 從一根股骨所得的骨髓懸液中取出10μl，與10μl臺盼藍(lán)混合，評估存活率，確保高于80%；
2. 1000g離心10min沉淀骨髓；
3. 用25ml預(yù)熱的含抗真菌藥物的CCM重懸骨髓（處理大鼠骨髓細(xì)胞使用抗真菌藥物，人骨髓細(xì)胞不使用）；
4. 將25ml細(xì)胞懸液加入到15ml直徑的組織培養(yǎng)板中，37℃，5%CO_²環(huán)境下至少孵育15h；
5. 從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)板，吸出培養(yǎng)基；
6. 用20ml預(yù)熱的PBSA潤洗單層細(xì)胞。重復(fù)潤洗過程3次，將最后的洗滌產(chǎn)物加入30ml預(yù)熱的含抗菌藥物的新鮮CCM中（只有大鼠細(xì)胞使用抗真菌藥物）；
7. 如有需要每隔兩天重復(fù)步驟6，維持6—14天；
8. 每3天用倒置顯微鏡觀察單層細(xì)胞。貼壁、成纖維細(xì)胞樣的MSCs集落可以在培養(yǎng)板中清洗可見。某些情況下，這可能是造成細(xì)胞污染的信號，但這些細(xì)胞隨著細(xì)胞傳代過程可被去除。當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到40%—50%匯合時，按照MSCs自我更新的集落形成單位測定的方法處理細(xì)胞。這些MSCs標(biāo)記為0代；