A：一般5×10⁶足夠。但要看是哪種細(xì)胞，有的細(xì)胞的體積就很小，而有的細(xì)胞則鋪得很開。常規(guī)做WB一個(gè)孔道上樣要10⁵個(gè)細(xì)胞。但也和目的蛋白及提取的方式有關(guān)。如果是膜蛋白或是某細(xì)胞器內(nèi)分布的蛋白細(xì)胞數(shù)得增多。

 

A：可以，甚至可以同時(shí)測(cè)十幾種樣品。

 

A：－80℃，一年沒有問題。關(guān)鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細(xì)菌污染

 

A：Western Blot一般上樣30－100微克不等，結(jié)果跟目的蛋白的豐度、上樣量、一二抗的量和撫育時(shí)間都有關(guān)系，也與顯色時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)。開始摸條件時(shí)，為了拿到陽(yáng)性結(jié)果，各個(gè)步驟都可以量多一點(diǎn)時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)，當(dāng)然背景也就出來了。要拿到好的結(jié)果，如果抗體好的話比較容易，抗體不好的話就需要反復(fù)地試了，當(dāng)然有的不適合Western Blot的怎樣做也不行。所以拿到好的結(jié)果不容易。

 

A：必須進(jìn)行研磨、勻漿處理，蛋白質(zhì)溶解度會(huì)更好，離心要充分，還有一點(diǎn)就是組織中的蛋白酶活性更強(qiáng)，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ和蛋白酶抑制劑cocktail）。

 

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