葉綠素熒光技術發(fā)展歷程及測量原理
葉綠素熒光，作為光合作用研究的探針，得到了廣泛的研究和應用。葉綠素熒光不僅能反映光能吸收、激發(fā)能傳遞和光化學反應等光合作用的原初反應過程，而且與電子傳遞、質子梯度的建立及ATP合成和CO2固定等過程有關。幾乎所有光合作用過程的變化均可通過葉綠素熒光反映出來，而熒光測定技術不需破碎細胞，不傷害生物體，因此通過研究葉綠素熒光來間接研究光合作用的變化是一種簡便、快捷、可靠的方法。目前，葉綠素熒光在光合作用、植物脅迫生理學、水生生物學、海洋學和遙感等方面得到了廣泛的應用。
發(fā)展歷史
葉綠素熒光現(xiàn)象是由傳教士Brewster首次發(fā)現(xiàn)的。1834年Brewster發(fā)現(xiàn)，當一束強太陽光穿過月桂葉子的乙醇提取液時，溶液的顏色變成了綠色的互補色——紅色，而且顏色隨溶液的厚度而變化，這是歷史上對葉綠素熒光及其重吸收現(xiàn)象的首次記載。后來，Stokes（1852）認識到這是一種光發(fā)射現(xiàn)象，并使用了“fluorescence”一詞。1874年，Müller發(fā)現(xiàn)葉綠素溶液稀釋后，熒光強度比活體葉子的熒光強得多。盡管Müller提出葉綠素熒光和光合作用之間可能存在相反的關系，但由于他的實驗沒有對照，實驗條件控制不嚴格，因此人們并沒有將葉綠素熒光誘導（瞬變）現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)歸功于Müller。
Kautsky是公認的葉綠素熒光誘導現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)者。1931年，Kautsky和Hirsch用肉眼觀察并記錄了葉綠素熒光誘導現(xiàn)象(Lichtenthaler，1992；Govindjee，1995)。他們將暗適應的葉子照光后，發(fā)現(xiàn)葉綠素熒光強度隨時間而變化，并與CO2的固定有關（圖3.1）。他們得到的主要結論如下：1）葉綠素熒光迅速升高到最高點，然后下降，最終達到一穩(wěn)定狀態(tài)，整個過程在幾分鐘內完成。2）曲線的上升反映了光合作用的原初光化學反應，不受溫度（0℃和30℃）和HCN處理的影響。若在最高點時關掉光，則熒光迅速下降。3）熒光強度的變化與CO2的固定呈相反的關系，若熒光強度下降，則CO2固定增加。這說明當熒光強度降低時，較多的光能用于轉變成化學能。4）奇怪的是（照光后）CO2的固定有一個延滯期，似乎說明“光依賴”的過程對CO2固定過程的進行是必需的。另一個未得到解釋的現(xiàn)象是若在熒光誘導結束后關掉光，則熒光水平的恢復需要很長時間。在Kautsky的發(fā)現(xiàn)之后，人們對葉綠素熒光誘導現(xiàn)象進行了廣泛而深入的研究，并逐步形成了光合作用熒光誘導理論，被廣泛應用于光合作用研究。由于Kautsky的杰出貢獻，葉綠素熒光誘導現(xiàn)象也被稱為Kautsky效應（Kautsky Effect）。
量子產量
細胞內的葉綠素分子通過直接吸收光量子或間接通過捕光色素吸收光量子得到能量后，從基態(tài)（低能態(tài)）躍遷到激發(fā)態(tài)（高能態(tài)）。由于波長越短能量越高，故葉綠素分子吸收紅光后，電子躍遷到最低激發(fā)態(tài)；吸收藍光后，電子躍遷到比吸收紅光更高的能級（較高激發(fā)態(tài)）。處于較高激發(fā)態(tài)的葉綠素分子很不穩(wěn)定，在幾百飛秒（fs，1 fs=10－15 s）內，通過振動弛豫向周圍環(huán)境輻射熱量，回到最低激發(fā)態(tài)（圖3.2）。最低激發(fā)態(tài)的葉綠素分子可以穩(wěn)定存在幾納秒（ns，1 ns=10－9 s）。
處于較低激發(fā)態(tài)的葉綠素分子可以通過幾種途徑釋放能量回到穩(wěn)定的基態(tài)。能量的釋放方式有如下幾種（圖3.3）（Campbell et al.，1998；Roháček & Barták，1999；Malkin & Niyogi，2000）：1）重新放出一個光子，回到基態(tài)，即產生熒光。由于部分激發(fā)能在放出熒光光子之前以熱的形式逸散掉了，因此熒光的波長比吸收光的波長長，葉綠素熒光一般位于紅光區(qū)。2）不放出光子，直接以熱的形式耗散掉（非輻射能量耗散）。3）將能量從一個葉綠素分子傳遞到鄰近的另一個葉綠素分子，能量在一系列葉綠素分子之間傳遞，最后到達反應中心，反應中心葉綠素分子通過電荷分離將能量傳遞給電子受體，從而進行光化學反應。以上這3個過程是相互競爭的，往往是具有最大速率的過程處于支配地位。對許多色素分子來說，熒光發(fā)生在納秒級，而光化學發(fā)生在ps級，因此當光合生物處于正常的生理狀態(tài)時，天線色素吸收的光能絕大部分用來進行光化學反應，熒光只占很小的一部分。
活體細胞內由于激發(fā)能從葉綠素b到葉綠素a的傳遞幾乎達到100%的效率，因此檢測不到葉綠素b熒光。在室溫下，絕大部分（約90%）的活體葉綠素熒光來自PSⅡ的天線色素系統(tǒng)，而且光合器官吸收的能量只有約3%～5%用于產生熒光（林世青，1996；Krause & Weis，1991）。
飽和脈沖技術工作原理
所謂飽和脈沖技術，就是打開一個持續(xù)時間很短（一般小于1 s）的強光關閉所有的電子門（光合作用被暫時抑制），從而使葉綠素熒光達到最大。飽和脈沖（Saturation Pulse, SP）可被看作是光化光的一個特例。光化光越強，PS II釋放的電子越多，PQ處累積的電子越多，也就是說關閉態(tài)的電子門越多，F(xiàn)越高。當光化光達到使所有的電子門都關閉（不能進行光合作用）的強度時，就稱之為飽和脈沖。
打開飽和脈沖時，本來處于開放態(tài)的電子門將該用于光合作用的能量轉化為了葉綠素熒光和熱，F(xiàn)達到最大值。
經過充分暗適應后，所有電子門均處于開放態(tài)，打開測量光得到Fo，此時給出一個飽和脈沖，所有的電子門就都將該用于光合作用的能量轉化為了熒光和熱，此時得到的葉綠素熒光為Fm。根據(jù)Fm和Fo可以計算出PS II的最大量子產量Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm，它反映了植物的潛在最大光合能力。
在光照下光合作用進行時，只有部分電子門處于開放態(tài)。如果給出一個飽和脈沖，本來處于開放態(tài)的電子門將該用于光合作用的能量轉化為了葉綠素熒光和熱，此時得到的葉綠素熒光為Fm’。根據(jù)Fm’和F可以求出在照光條件下PSII反應中心部分關閉的情況下的實際原初光能捕獲效率=ΦPSII=ΔF/Fm’=(Fm’-F)/Fm’，它反映了植物目前的實際光合效率。
在光照下光合作用進行時，只有部分電子門處于關閉態(tài)，實時熒光F比Fm要低，也就是說發(fā)生了熒光淬滅（quenching）。植物吸收的光能只有3條去路：光合作用、葉綠素熒光和熱。根據(jù)能量守恒：1=光合作用+葉綠素熒光+熱�？梢缘贸觯喝~綠素熒光=1－光合作用－熱。也就是說，葉綠素熒光產量的下降（淬滅）有可能是由光合作用的增加或熱耗散的增加引起的。由光合作用的引起的熒光淬滅稱之為光化學淬滅（photochemical quenching, qP）；由熱耗散引起的熒光淬滅稱之為非光化學淬滅（non-photochemical quenching, qN或NPQ）。光化學淬滅反映了植物光合活性的高低；非光化學淬滅反映了植物耗散過剩光能為熱的能力，也就是光保護能力。
光照狀態(tài)下打開飽和脈沖時，電子門被完全關閉，光合作用被暫時抑制，也就是說光化學淬滅被全部抑制，但此時熒光值還是比Fm低，也就是說還存在熒光淬滅，這些剩余的熒光淬滅即為非光化學淬滅。淬滅系數(shù)的計算公式為：qP=(Fm’-Fs)/Fv’=1-(Fs-Fo’)/(Fm’-Fo’)；qN=(Fv-Fv’)/Fv=1-(Fm’-Fo’)/(Fm-Fo)；NPQ=(Fm-Fm’)/Fm’=Fm/Fm’-1。
標簽：
葉綠素熒光
