小鼠轉(zhuǎn)基因的“三段進(jìn)階”。

這里我們說的轉(zhuǎn)基因小鼠是指：將一段外源基因隨機(jī)插入到小鼠基因組中，獲得過量表達(dá)目的基因的小鼠模型。

轉(zhuǎn)基因1.0 顯微注射法構(gòu)建完全隨機(jī)插入轉(zhuǎn)基因小鼠

用顯微注射針將線性化的外源DNA片段直接注入小鼠受精卵的原核中，使外源基因整合到小鼠基因組中，從而獲得轉(zhuǎn)基因小鼠。

優(yōu)點(diǎn)：

• 過程較簡(jiǎn)單
• 周期短（3個(gè)月左右獲得founder小鼠）
• 可進(jìn)行大片段插入，如BAC轉(zhuǎn)基因

缺點(diǎn)：

• 隨機(jī)整合
• 整合位點(diǎn)隨機(jī)造成基因組的重排、易位缺失
• 整合位點(diǎn)、多拷貝串聯(lián)整合都會(huì)導(dǎo)致外源基因表達(dá)率低甚至不表達(dá)
• 外源基因插入可能破壞小鼠內(nèi)源基因
• 獲得founder小鼠（基因型鑒定為陽性）后需要建系來篩選外源基因高表達(dá)的line，并且至少需要2個(gè)表達(dá)的line，相互印證表型才可以

也就是說：

外源DNA是怎么整合到小鼠基因組里的，你不知道。

外源DNA整合在哪里，你也不知道。

外源DNA到底有幾個(gè)拷貝整合進(jìn)去了，你還是不知道。

外源DNA整合進(jìn)去以后能不能被表達(dá)出來，你就更不知道了。

說白了，全靠RP。

不過有一點(diǎn)你可以知道，那就是獲得的founder小鼠越多，篩選到高表達(dá)line的可能性就越高。

轉(zhuǎn)基因2.0 利用DNA轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)提高轉(zhuǎn)基因的表達(dá)陽性率

DNA轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座遵循 “切離-粘貼 (cut and paste)”機(jī)制，在轉(zhuǎn)座酶 (transposase)的催化下 ，DNA轉(zhuǎn)座子及中間的DNA片段被從原始位置切離并插入到新的基因組位置。

用到轉(zhuǎn)基因小鼠制備的過程中，就是將外源待表達(dá)的DNA片段構(gòu)建到轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒中去，并和轉(zhuǎn)座酶mRNA一起顯微注射到小鼠受精卵中，轉(zhuǎn)座酶將外源DNA片段從質(zhì)粒中切離下來，插入到小鼠基因組中去。

常用于哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)座子有：piggyBac、SleepingBeauty (SBll) 和Tol2。其中，piggyBac轉(zhuǎn)座子在轉(zhuǎn)座酶的輔助下特異性識(shí)別基因組中5’-TTAA-3’位點(diǎn)，精確地剪切和插入不留下印跡；并且在隨機(jī)插入基因組的過程中，更傾向于插入有活躍轉(zhuǎn)錄的位置；而且轉(zhuǎn)座效率比其他兩個(gè)高。

轉(zhuǎn)基因1.0 vs 2.0的性能對(duì)比

從這張表格中，你不難發(fā)現(xiàn) 2.0進(jìn)階版雖然仍舊不能確定整合位點(diǎn)與外源DNA的插入數(shù)量，但在相同的制備周期里， 2.0進(jìn)階版提高了外源基因表達(dá)的效率，很大程度上能夠避免轉(zhuǎn)基因1.0“竹籃打水一場(chǎng)空”的遺憾，不失為性價(jià)比更高的一種方式。

當(dāng)然，如果你和小編一樣，對(duì)不確定的事情特別沒有安全感，又對(duì)自己的RP沒什么自信的話，一定馬上就要發(fā)出這樣的怒吼了：難道就沒有一種既能明確而準(zhǔn)確地插入外源基因又能保證表達(dá)的方法嗎？

轉(zhuǎn)基因3.0 定點(diǎn)轉(zhuǎn)基因 —— “一清二白”的過表達(dá)神器

一清：

整合位點(diǎn)清楚

二白：

1）整合拷貝數(shù)明白

2）不需要建系，后代小鼠基因型明白

更重要的是：外源基因表達(dá)有保證！

Rosa26位點(diǎn)是目前最為常用的定點(diǎn)整合位點(diǎn)之一。它位于小鼠6號(hào)染色體，是一個(gè)非編碼基因，已被證明在大部分組織和細(xì)胞中都有表達(dá)。表達(dá)比較活躍的基因區(qū)域因?yàn)樾枰�轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)入基因組結(jié)構(gòu)不會(huì)被異染色質(zhì)化，因此在這個(gè)區(qū)域定點(diǎn)插入外源基因，在各組織中表達(dá)的可能性都非常高。所以，Rosa26被廣泛用來作為外源基因表達(dá)的安全位點(diǎn)。當(dāng)然，還有一些其它的安全位點(diǎn)，我們下期再詳細(xì)介紹哈~

外源DNA片段怎么整合到Rosa26位點(diǎn)里呢？依靠同源重組。

無論是ES細(xì)胞打靶還是CRISPR途徑，都需要構(gòu)建一個(gè)同源重組載體，在Rosa26基因兩段同源臂之間放上外源基因片段。一般情況下，為了實(shí)現(xiàn)外源基因的高表達(dá)，可以選擇類似CAG啟動(dòng)子這樣的廣泛型強(qiáng)啟動(dòng)子。在組成型表達(dá)的基礎(chǔ)上，我們還可以更靈活地實(shí)現(xiàn)條件性——組織特異性或時(shí)間特異性——過表達(dá)，方法很簡(jiǎn)單，就是在啟動(dòng)子和外源cDNA之間加上一段兩側(cè)帶有l(wèi)oxP位點(diǎn)的multi-polyA轉(zhuǎn)錄終止（STOP）信號(hào)，像這樣：

構(gòu)建一個(gè)定點(diǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠花費(fèi)的時(shí)間會(huì)長(zhǎng)一些，即使采用CRISPR技術(shù)也要6個(gè)月左右。不過話說回來，如果算上隨機(jī)插入轉(zhuǎn)基因小鼠的建系時(shí)間，小編覺得定點(diǎn)轉(zhuǎn)基因還是更有優(yōu)勢(shì)噠~

你也許還會(huì)問，靠同源重組能插入幾十kb那么大的片段嗎？

不用怕，我們可以用RMCE（重組酶介導(dǎo)的盒式交換）來解決超大片段的定點(diǎn)過表達(dá)難題哦！RMCE技術(shù)基于利用Rosa26位點(diǎn)中帶有側(cè)翼為特定重組酶識(shí)別位點(diǎn)（例如：loxP、lox511位點(diǎn)或F3、Frt位點(diǎn)）的工具ES細(xì)胞系。構(gòu)建帶有外源片段的第二個(gè)轉(zhuǎn)基因（側(cè)翼也帶有特異性重組酶識(shí)別位點(diǎn)）交換質(zhì)粒，在表達(dá)重組酶（例如Cre或Flpe）的幫助下在ES細(xì)胞中催化盒式交換，從而完成超大片段（20-30kb）的定點(diǎn)整合。就像這樣：

轉(zhuǎn)基因的方法很多，不同方法有它各自的優(yōu)缺點(diǎn)，綜合考量，選擇最適合方法~