自從 Sanger等(1975)引人雙脫氧核苷三磷酸( ddNTP)作為鏈終止劑,DNA序列測定技術(shù)得到迅速發(fā)展。 ddNTP在DNA聚合酶作用下,通過其5三磷酸基團可以摻入到正在延伸的DNA鏈中,但由于其脫氧核糖3位置缺少一個羥基,因此不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵,使得DNA鏈的延伸被終止。根據(jù)此原理,在DNA合成反應(yīng)混合物的4種dNTP中加入一定比例的一種 ddNTP,dNTP參與的鏈延伸將與ddTP參與的鏈終止發(fā)生隨機競爭,最終反應(yīng)產(chǎn)物是一系列的寡核苷酸鏈,其長度取決于從用以起始DNA合成的引物末端到出現(xiàn)過早鏈終止的位置之間的距離。在4組獨立的酶反應(yīng)中分別采用4種不同的dNTP,結(jié)果將產(chǎn)生4組寡核苷酸鏈,它們將分別終止于模板鏈的每個A、C、G或T的位置上,通過電泳分離和放射自顯影,就可以進行序列判讀。

 

PCR測序根據(jù)標(biāo)記的方式不同和循環(huán)的次數(shù)不同可分為直接測序法和循環(huán)測序法。

 

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 直接測序法 

 

一、原理

PCR擴增獲得雙鏈DNA產(chǎn)物經(jīng)變性形成單鏈,測序引物與其中一條模板鏈上的互補序列退火。退火的引物在低進行性反應(yīng)條件下(如低溫和低dNTP濃度),通過DNA聚合酶催化作用延伸20~80個核苷酸;由于此反應(yīng)體系中摻入放射性標(biāo)記的dNTP,能使新合成的DNA鏈中含有多個放射性標(biāo)記,便于產(chǎn)生高放射顯影度。標(biāo)記的DNA鏈在高進行性反應(yīng)條件下,通過DNA聚合酶催化進行延伸,通過在反應(yīng)體系中摻入 ddNTP,使鏈延伸反應(yīng)終止。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過電泳分離和放射自顯影,就可以進行序列判讀。

 

二、材料

(1)DNA模板PCR產(chǎn)物離子交換色譜純化,作為DNA模板,濃度為:0.01~0.1mmol/L。

 

(2)引物20個核苷酸的DNA引物可以不經(jīng)過純化,直接用作測序引物,引物濃度 l mmol/L

 

(3)DNA聚合酶要求該酶在低溫條件下仍具有活性,以便有效地在新合成的DNA鏈中摻入放射性標(biāo)記。比如USB/ Amersham公司生產(chǎn)的測序酶2.0。

 

(4)測序反應(yīng)緩沖液根據(jù)測序酶具體而定,如測序酶2.0的反應(yīng)緩沖液可用40mmol/LTris-HCl(pH7. 5), 20mmol/L MgCI, Fl 50mmol/L NaCl.

 

(5)放射性標(biāo)記的dNTP一般為[aP]dATP、[a3P]dATP或[a3S]dATP。

 

三、方法

(1)制備鏈延伸終止反應(yīng)混合物分別在4個微量離心管中各加入一種 dNTP/ddNTP的混合物2.5,其中dNTP和dNTP濃度分別為80m0/L和8pmol/L,37℃預(yù)熱5mine

 

(2)制備退火混合物在一個微量離心管中加入PCR擴增DNA1pmol,測序引物1012p5×測序反應(yīng)緩沖液,用水調(diào)整至總反應(yīng)體積10pl

在加熱儀內(nèi)94~96℃加熱8min后,迅速放入冰浴中冷卻lmin(適合于雙鏈DNA模板),或者在加熱儀內(nèi)65℃加熱6min后在加熱儀內(nèi)自然冷卻到30℃(適合于單鏈DNA模板)。

1000r/min離心10s后在冰浴中冷卻,并迅速進行下一步操作。

 

(3)標(biāo)記反應(yīng)在退火混合物中加入2l預(yù)冷的dNTP混合物(含dTTP、dGTP和dCTP各0.75mol/L,5C的[a2P]dATP),1plo.1mol/LDDT,現(xiàn)稀釋的測序酶2U,并用水將反應(yīng)體系調(diào)整到15.5,混勻后在冰上孵育2min,放射性標(biāo)記新合成的DNA鏈。

 

(4)鏈延伸終止反應(yīng)將3.5標(biāo)記混合物分別加入4管鏈延伸終止反應(yīng)混合物中,37℃進行鏈延伸終止反應(yīng)5min。

 

(5)終止反應(yīng)體系在各管中加入4終止液(95%甲酰胺,20mmo/ L EDTA,0.05%溴酚藍,0.05%二甲苯腈藍FF),終止反應(yīng)。樣品可以一70℃保存2~7d。電泳前在電熱儀上80℃加熱3min。

 

(6)電泳分離和放射自顯影每一泳道上樣2~3μl,進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。

P標(biāo)記的需要過夜曝光顯影,若用P標(biāo)記的需要2~3d曝光顯影,讀片。

 

四、注意事項

①標(biāo)記反應(yīng)最為關(guān)鍵,應(yīng)在低進行性反應(yīng)條件下進行。退火后引物只被延伸20~80個核苷酸,并在新合成的DNA鏈中摻入多個放射性標(biāo)記。對高GC堿基含量的DNA模板,可用[aP]dCTP代替[aP]dATP。

 

②對高GC堿基含量的DNA模板,鏈延伸終止反應(yīng)混合物中應(yīng)用7-脫氧2dGTP替代dGTP,以消除電泳過程由于壓縮現(xiàn)象產(chǎn)生的假帶。

 

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 循環(huán)測序法 

 

一、原理

循環(huán)測序法是利用熱循環(huán)儀高效的自動循環(huán)能力,使鏈終止的序列產(chǎn)物以線性方式獲得擴增,從而產(chǎn)生高顯影度的序列梯度。首先將PCR擴增的DNA經(jīng)變性形成單鏈形式,使標(biāo)記引物(P、生物素或熒光標(biāo)記)與其中的一條鏈上的互補序列退火。退火后的引物在耐熱DNA聚合酶催化下發(fā)生鏈延伸終止反應(yīng)。由此產(chǎn)生的模板鏈與延伸終止鏈形成的部分雙鏈產(chǎn)物在下一輪測序循環(huán)中,再次被變性,釋放出模板鏈,作為又一輪引發(fā)反應(yīng)的模板,同時積累下每輪循環(huán)產(chǎn)生的鏈終止產(chǎn)物。這種循環(huán)步驟重復(fù)20~40次,使鏈終止產(chǎn)物以線性方式擴增。

與直接測序法相比較,循環(huán)測序法有如下優(yōu)點:所需的模板DNA量少;在高溫下進行,可使DNA聚合酶催化的聚合反應(yīng)能夠通過模板二級結(jié)構(gòu)的區(qū)域;多輪的變性步驟便于對質(zhì)粒DNA、ADNA、黏粒DNA和PCR產(chǎn)物等雙鏈DNA模板進行測定,不需要經(jīng)過一個單獨的變性步驟而直接進行測序。

 

二、材料

(1)模板可用PCR擴增好的DNA作模板,也可使用低濃度的dNTP(10~20mol/L)和引物(1mmol/L)來進行靶DNA的PCR擴增,然后直接用PCR產(chǎn)物作為模板。DNA模板濃度:0.01mmol/L

質(zhì)粒DNA模板用質(zhì)粒純化試劑盒提取。對于高拷貝數(shù)的質(zhì)�？梢灾苯訌木�落中獲得測序。測序反應(yīng)的質(zhì)粒典型用量:50~200mol

其它模板(M13、黏粒及ADNA)的制備為常規(guī)分子生物學(xué)手段。M3和ADNA作為模板用量:10~100mo黏粒DNA作為模板用量:50~200mol

 

(2)測序引物同位素標(biāo)記測序引物:用[yP]ATP或[γP]ATP和T4多聚核苷酸激酶對引物的5末端進行同位素標(biāo)記。引物濃度:0.1~0.2mmol/L

非同位素標(biāo)記測序引物:用熒光標(biāo)記4種雙脫氧核苷酸,可以進行以熒光為基礎(chǔ)的雙脫氧測序反應(yīng)。

 

(3)DNA聚合酶應(yīng)為無3→5外切活性的耐熱DNA聚合酶。如 Taq dnA聚合酶。

 

(4)測序反應(yīng)緩沖液根據(jù)所用的聚合酶具體而定。

 

(5)放射性標(biāo)記的dNTP根據(jù)所用的聚合酶具體而定

 

三、方法

(本操作方法是以同位素標(biāo)記為基礎(chǔ)的測序)

 

(1)標(biāo)記引物取10~15pmol測序引物、50pCi的[ y-3P]ATP、5μ10×激酶緩沖液(商品廠家提供),加水至反應(yīng)體系50,混勻后37℃預(yù)熱5min

加人1μ現(xiàn)稀釋的T4多聚核苷酸激酶(10U),37℃孵育30min;再加入10U的T4多聚核苷酸激酶,37℃繼續(xù)孵育30min。

通過凝膠過濾柱除去未摻入的[yP]ATP

標(biāo)記好的引物可在-70℃保存2周以上。

 

(2)制備dNTP/ ddNTP混合物在4個微量離心管中各加入一種dNTP/ ddNTP混合物2ul

 

(3)制備反應(yīng)混合物取相應(yīng)的DNA模板、標(biāo)記的測序引物1~2pmol、3pl的10×測序反應(yīng)緩沖液、5U的 Taq dnA聚合酶,加水至總體積20l,混勻。在該混合物中加入某些試劑,如DMSO、 Triton X-100、吐溫20或NP40等,徹底混合均勻,可以提高序列梯度的質(zhì)量。

 

(4)循環(huán)反應(yīng)分別取反應(yīng)混合物4團l加人4管dNTP/dNTP混合物中,然后置于9℃的熱循環(huán)儀上進行循環(huán)反應(yīng)。每次循環(huán)包括:94℃變性1min、40~60℃退火30s和72℃鏈延伸終止30s。循環(huán)次數(shù):20~40次。

 

(5)終止反應(yīng)體系循環(huán)結(jié)束后,在各管中加入4pl終止液(95%甲酰胺,20mmol/LEDTA,0.05%溴酚藍,0.05%二甲苯腈藍FF),混勻。樣品可在一70℃保存2~7d。電泳前在電熱儀上80℃加熱3min

 

(6)電泳分離和序列判讀每一泳道上樣2~3pl,電泳。采用放射自顯影方法進行序列判讀標(biāo)記的需要過夜曝光顯影,若用P標(biāo)記的需要2~3d曝光顯影。

 

四、注意事項

①在標(biāo)記引物過程中,為獲得高比活的標(biāo)記引物,反應(yīng)體系中引物、激酶及[YP]ATP要保持在一個最佳水平

 

②確定最佳dNTP/dNTP比例非常關(guān)鍵,應(yīng)采用產(chǎn)生低本底、高顯影度的序列梯度所需要的最佳dNTP/dNTP比例。

 

③為了提高靠近引物(1~100個堿基范圍內(nèi))的序列梯度的自顯影強度,可以向測序反應(yīng)體系中加人Mn2,提高DNA聚合酶對摻入 ddTP的效率( Tabor等,1989)。而當(dāng)為了提高遠(yuǎn)離引物(200~400個堿基范圍內(nèi))的序列梯帶的自顯影強度,則需要提高鏈延伸終止反應(yīng)混合液中dNTP的含量,具體依所用聚合酶而定。

 

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 全自動DNA測序法 

 

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,DNA測序已從人工操作發(fā)展到用自動測序儀進行全自動測序,使得測序的準(zhǔn)確度、樣品序列判讀長度和速度有了極大的提高。如今科研工作者只需準(zhǔn)備好所需測序的樣品,送至專業(yè)的測序公司用全自動DNA測序儀(如 Applied biosystems的377型全自動DNA測序儀)進行測序即可。本節(jié)簡單介紹全自動DNA測序儀的特點,不對全自動測序儀的具體操作步驟和注意事項等做詳細(xì)介紹。

 

全自動測序儀一般由:電泳系統(tǒng),激光檢測裝置,軟件,計算機和打印機等幾部分組成。

 

全自動測序儀采用4種熒光染料標(biāo)記核苷酸、在一個泳道測序的方法,有效地避免了因單一標(biāo)記方法(如同位素標(biāo)記)中4個泳道電泳時所造成的遷移率不同對測序準(zhǔn)確度的影響。

 

由于可以采用兩種熒光標(biāo)記方法(標(biāo)記dNTP法和標(biāo)記引物5端法)、多種DNA聚合酶和測序試劑盒,使得測序DNA模板種類大大增加,如單鏈DNA、雙鏈DNA和PCR產(chǎn)物等。

 

全自動測序儀可以采用激光激發(fā),使得代表不同堿基信息的不同顏色熒光先經(jīng)過光柵分光,經(jīng)CCD攝像機同步成像,一次掃描可以檢出多種熒光,使得測序速度高達200bp/h,一個樣品一次可以測定700余個堿基。

 

在電泳技術(shù)方面,簡化了灌膠技術(shù),采用精確控溫,提高了測序的精確度

 

應(yīng)用多種軟件,可以進行DNA片段大小和定量分析、遺傳基因的組型分析、DNA亞克隆序列拼接、DNA和蛋白質(zhì)序列比較等。

 

全自動測序儀可以使得一次測序樣品數(shù)量大大增加,多達96個樣品,極大地提高了工作效率�，F(xiàn)在國內(nèi)有許多公司進行全自動測序,只需要將克隆的菌株交給公司,一般在3~5d后即可得到結(jié)果,測序的長度在每個反應(yīng)500~800bp左右。

 

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 應(yīng)用 

 

PCR測序是對生物遺傳信息的最終判定。隨著各種基因組計劃的開展,PCR測序工作在不斷加強和完善,特別是全自動DNA測序儀的開發(fā),為提前完成人類基因組計劃奠定了基礎(chǔ)。此外,在臨床遺傳病、傳染性疾病和癌癥的基因診斷、農(nóng)業(yè)畜牧業(yè)的動植物育種、法醫(yī)鑒定等領(lǐng)域上有廣泛的應(yīng)用前景。過去由于全自動DNA測序的儀器成本較高,手工的同位素標(biāo)記的測序在國內(nèi)曾經(jīng)發(fā)揮過重要作用;但隨著國內(nèi)科研試驗條件的改變,全自動DNA測序儀已在國內(nèi)廣泛應(yīng)用于序列的測定,但全自動DNA測序儀廣泛應(yīng)用于突變的檢測目前還受國內(nèi)實驗條件的限制。

 

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