作者
Eva Graf
安捷倫科技有限公司
Waldbronn, Germany

摘要
本應(yīng)用簡報按照 Agilent SureSelect^QXT WGS 文庫制備方案，介紹了 Agilent 4200 TapeStation 系統(tǒng)在工作流程中的樣品質(zhì)量控制 (QC) 性能。基因組 DNA ScreenTape 分析法是對基因組 DNA 起始材料進(jìn)行系列定量分析并提供完整性信息的可靠方法。安捷倫高靈敏度 D5000 ScreenTape 分析法可在測序前對擴(kuò)增的標(biāo)簽文庫進(jìn)行分子量測定和定量分析。數(shù)據(jù)還表明，采用 DNA ScreenTape 分析法所獲得的結(jié)果與使用 Agilent 2100 生物分析儀系統(tǒng)和 Qubit 熒光計進(jìn)行分析所得到的信息相一致。

前言
Agilent SureSelect^QXT 全基因組文庫制備試劑盒可生成用于 Illumina 配對末端多重測序的文庫。SureSelect^QXT 文庫制備對基因組 DNA (gDNA) 的起始量變化非常敏感。本方案建議使用 Qubit 儀器進(jìn)行兩次系列熒光分析來定量。采用基因組 DNA ScreenTape 分析法在 Agilent 4200 TapeStation 系統(tǒng)上運(yùn)行相同樣品，比較這兩種方法所獲得的結(jié)果。gDNA 起始量的偏差會導(dǎo)致所得片段分布不理想，使擴(kuò)增文庫中過大或過小的 DNA 片段所占比例過高。這種效應(yīng)可以通過由各種 gDNA 起始材料（從低豐度到高豐度）產(chǎn)生的額外文庫來說明。

擴(kuò)增文庫使用安捷倫高靈敏度 D5000 ScreenTape 分析法及 4200 TapeStation 系統(tǒng)進(jìn)行分析，將其結(jié)果與 SureSelect^QXT 方案推薦的高靈敏度 DNA 分析法及 Agilent 2100 生物分析儀系統(tǒng)分析所得結(jié)果進(jìn)行比較。

擴(kuò)增文庫的分析結(jié)果顯示，高靈敏度 D5000 ScreenTape 分析與 2100 生物分析儀系統(tǒng)獲得的分子量和摩爾濃度結(jié)果相一致。

材料與方法
4200 TapeStation 系統(tǒng) (G2991AA)、2100 生物分析儀系統(tǒng) (G2939AA)、SureCycler 8800 熱循環(huán)儀 (G8800A)、用于 WGS 的 SureSelect^QXT 文庫制備試劑盒 (G9682A)、高靈敏度 D5000 ScreenTape (5067-5592) 和試劑 (5067-5593)、基因組 DNA ScreenTape (5067-5365)  和試劑 (5067-5366)、高靈敏度 DNA 試劑盒 (5067-4626)，以及 OneSeq 參比 DNA 男性 (5190-8848) 購自安捷倫科技公司。NanoDrop 1000、Qubit 3.0 熒光計 (Q33216) 和Qubit dsDNA BR 分析試劑盒 (Q32850) 購自賽默飛世爾科技公司。使用區(qū)域功能來實現(xiàn) DNA 文庫的定量測定。除非另有說明，否則所有分析均按照生產(chǎn)商的方案和指南進(jìn)行。
 
結(jié)果與討論
圖 1 說明了使用 gDNA 作為起始材料生成全基因組測序 (WGS) 文庫的 SureSelect^QXT 方案。簡而言之，樣品在一步酶解步驟中進(jìn)行碎裂和接頭標(biāo)記，然后進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，在此期間對接頭連接的片段進(jìn)行擴(kuò)增和標(biāo)記。然后使用磁珠清潔擴(kuò)增的接頭連接的文庫，并在測序前分析以確定合適的分子量、數(shù)量，并進(jìn)行純度（不含接頭二聚體產(chǎn)物）評估。

gDNA 的數(shù)量和完整性
SureSelect^QXT WGS 方案需要高質(zhì)量的 DNA 樣品，以獲得最佳性能和 gDNA 起始材料的精確定量結(jié)果。按照該方案使用配有 dsDNA BR 分析試劑盒的 Qubit 儀器進(jìn)行系列定量分析。將相同的樣品在 4200 TapeStation 系統(tǒng)和 NanoDrop 中均進(jìn)行6次重復(fù)基因組 DNA ScreenTape 分析。圖2顯示了獲自 4200 TapeStation 系統(tǒng)、Qubit 和 NanoDrop 的數(shù)據(jù)，說明了基因組 DNA ScreenTape 分析法適用于對 gDNA 起始材料進(jìn)行定量分析。采用UV 光譜法測定 gDNA 所得的量常會過高，這是由于其他緩沖液成分在 UV 光譜中也可能有吸收^[4]。



此外，基因組 DNA ScreenTape 分析法可在同一 QC 步驟中客觀評價樣品完整性。樣品完整性由 TapeStation 分析軟件的 DNA 完整值 (DIN) 計算功能自動測定（圖 3）。
 
與其他系統(tǒng)不同的是，基因組 DNA ScreenTape 分析方法及 4200 TapeStation 系統(tǒng)只需 1 µL 樣品即可在一步分析中同時對質(zhì)量和數(shù)量進(jìn)行評價。

Agilent SureSelect^QXT 全基因組文庫的片段分子量測定
除了 gDNA 起始材料的初始質(zhì)量控制外，SureSelect^QXT 方案還建議對擴(kuò)增文庫進(jìn)行質(zhì)量控制，從而確保在測序前顯示整個片段的分子量范圍。片段平均分子量顯著小于 600 bp 可能表明碎裂反應(yīng)中的 gDNA 過少，或者可能與測序數(shù)據(jù)的重復(fù)分析次數(shù)增加有關(guān)。相反，文庫中片段平均分子量過大（超過 1000 bp）可能表明碎裂反應(yīng)中的 gDNA 過多，并且可能需要更高的 DNA 濃度以在測序反應(yīng)中獲得最佳的群集密度。

為了證明這一點(diǎn)，制備起始量為 20、50 和 80 ng 的文庫，用 50 ng gDNA 樣品生成的文庫作為標(biāo)準(zhǔn)文庫。圖 4顯示了與 2100 生物分析儀系統(tǒng)相比，4200 TapeStation 系統(tǒng)在評估分子量測定方面的性能，通過用上述起始量對文庫進(jìn)行三次重復(fù)區(qū)域分析來評估。圖中的數(shù)據(jù)展現(xiàn)了兩個系統(tǒng)所得的文庫分子量有很好的相關(guān)性。



不同 gDNA 起始量的電泳疊加圖顯示，使用 2100 生物分析儀 (A) 和 4200 TapeStation (B) 系統(tǒng)，文庫片段分子量分布（圖 5）呈現(xiàn)出不同的彌散條帶曲線。50 ng 的最佳 gDNA 起始量可得到平均分子量在 600–1000 bp 之間的文庫曲線。最小的 gDNA 起始量產(chǎn)生的文庫通常會導(dǎo)致其分子量范圍趨向于更小。相反，gDNA 起始量過大會導(dǎo)致大 DNA 片段比例過高，從而產(chǎn)生的文庫的分子量范圍趨向于更大。此外，所有電泳圖均未顯示接頭二聚體產(chǎn)物，表明文庫純度很高。



SureSelect^QXT 全基因組文庫的定量分析
對于多重測序，將 SureSelect^QXT 全基因組文庫合并，使每個插入標(biāo)記的樣品在庫中的摩爾量相同。文庫的最佳起始濃度取決于測序平臺。它可能還需要根據(jù)文庫的 DNA 片段分子量范圍進(jìn)行優(yōu)化，以獲得所需的最終量和數(shù)據(jù)質(zhì)量。4200 TapeStation 和 2100 生物分析儀系統(tǒng)可在區(qū)域表中提供摩爾濃度定量數(shù)據(jù)和分子量信息（圖 6）。



對于每個由不同 gDNA 起始量產(chǎn)生的文庫，將其摩爾濃度繪制在兩個系統(tǒng)的對比圖中（圖 7）。



表 1 中的匯總數(shù)據(jù)表明，使用高靈敏度 D5000 ScreenTape 分析法得到的擴(kuò)增文庫的分子量和定量分析結(jié)果，與 SureSelect^QXT WGS 方案推薦的 2100 生物分析儀系統(tǒng)及高靈敏度 DNA 分析法得到的結(jié)果相一致。



結(jié)論
本應(yīng)用簡報證明了 Agilent 4200 TapeStation 是可用于 Agilent SureSelect^QXT WGS 文庫制備過程中進(jìn)行樣品分析的可靠系統(tǒng)。
高質(zhì)量 DNA 樣品和 gDNA 起始材料高重現(xiàn)性的定量結(jié)果是成功制備 SureSelect^QXT 文庫必不可少的條件。安捷倫基因組 DNA ScreenTape 分析法可對基因組 DNA 起始材料實現(xiàn)精確定量分析，并在同一 QC 步驟中對樣品完整性進(jìn)行評估。
安捷倫高靈敏度 D5000 ScreenTape 分析法是用于 SureSelect^QXT WGS 擴(kuò)增文庫的分子量測定和定量分析的理想工具。4200 TapeStation 系統(tǒng)除了具有與 SureSelect^QXT 方案推薦的Agilent 2100 生物分析儀系統(tǒng)等效的性能外，還具有高度靈活的樣品通量和易用性。
  <sup>2. G2991-90150. Agilent High Sensitivity D5000 ScreenTape Assay Quick Guide for 4200 TapeStation System（用于 4200TapeStation 系統(tǒng)的安捷倫高靈敏度 D5000 ScreenTape 分析快速指南）。http://www.agilent. com/cs/library/usermanuals/ Public/4200-TapeStation_HS- D5000_QG.pdf
3. G2991-90040. Agilent Genomic DNA ScreenTape Assay Quick Guide for 4200 TapeStation System（用于 4200 TapeStation 系統(tǒng)的安捷倫基因組 DNAScreenTape 分析快速指南）。http://www.agilent.com/ cs/library/usermanuals/ Public/4200-TapeStation_gDNA_ QG.pdf
4. O’Neill, M.; et al. Comparison of the TLDA with the Nanodrop and the reference Qubit system. J. Physics: Conference Series 2011, Volume 307, Issue 1. http://www.iopscience.iop. org/1742-6596/307/1/012047</sup>

^{僅限研究使用。
不可用于診斷目的。
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2017 年 7 月 1 日，中國出版
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