蛋白質(zhì)磷酸化是一種非常重要且廣泛存在于原核生物和真核生物中的翻譯后修飾調(diào)控方式,參與細(xì)胞的增殖、發(fā)育、分化、凋亡,細(xì)胞骨架調(diào)控、神經(jīng)活動(dòng)、肌肉收縮、新陳代謝及腫瘤發(fā)生等,對(duì)許多生物的細(xì)胞功能起著生物“開/關(guān)”作用。
蛋白質(zhì)磷酸化指由蛋白質(zhì)激酶催化的把ATP的磷酸基轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)氨基酸殘基（絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸）上的過程，是調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的機(jī)制，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程中起重要作用。異常的磷酸化事件常與許多疾病狀態(tài)相關(guān)。

在評(píng)估蛋白磷酸化時(shí)，可選擇的方法有很多，Western blot是評(píng)估蛋白磷酸化狀態(tài)的最常用方法。磷酸化蛋白的檢測(cè)具有挑戰(zhàn)性，因此在實(shí)驗(yàn)的各個(gè)階段都需要特別注意。Vilber為您提供幾條小妙招，助力您獲得更加滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
 

1.樣品處理：在穩(wěn)定的環(huán)境條件下細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的生成和分解處于動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)在體外從細(xì)胞和組織中提取蛋白時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶和磷酸酶就會(huì)被釋放出來或被激活，導(dǎo)致目的蛋白分解或去修飾，因此需要在提取物中添加適當(dāng)?shù)牡鞍酌浮⒘姿崦傅纫种苿�。選用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的裂解液，并在使用前進(jìn)行預(yù)冷，是防止樣品處理時(shí)蛋白降解和去修飾的有效方法。
2.選擇特異性的磷酸化抗體并檢測(cè)總蛋白的量：磷酸化抗體主要是針對(duì)磷酸化位點(diǎn)制備的是一種位點(diǎn)特異性的抗體。由于測(cè)得的磷酸化蛋白水平可能隨處理或凝膠上樣誤差而變化，所以需要用非磷酸化的抗體來檢測(cè)同源蛋白的總水平，以確定磷酸化組分相對(duì)于總組分的比例，并可充當(dāng)上樣對(duì)照。例如：H2O2誘導(dǎo)NIH3T3細(xì)胞衰老和AMPK通路抑制。用H2O2處理細(xì)胞，在不含H2O2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3-5天，可以通過AMPK的磷酸化水平，檢測(cè)到AMPK通路的受抑制情況。

Fig. 1 H2O2 induced senescence and AMPK pathway inhibition in NIH3T3 Cells. 

Xiaojuan Han et al., Aging Cell (2016) 15, pp416–427

3.封閉：做好封閉可以降低背景，提高檢測(cè)靈敏度。封閉時(shí)建議選擇BSA配合TBS緩沖液作為封閉液使用，不建議用脫脂牛奶作為封閉液，因?yàn)榕Ｄ讨械牡鞍踪|(zhì)可能會(huì)干擾磷酸化蛋白的檢測(cè)�？墒覝胤忾]2小時(shí)或者4℃封閉過夜。封閉時(shí)膜與封閉液充分接觸，避免長(zhǎng)時(shí)間離開封閉液。
4.洗膜：洗膜時(shí)要選用合適的洗滌液，選用TBST作為洗滌緩沖液，洗膜四次，每次10分鐘，在脫色搖床上進(jìn)行，可以很好的去除膜上非特異性的結(jié)合，降低背景。而使用PBS時(shí)，緩沖液中的磷酸根，則會(huì)產(chǎn)生干擾靶蛋白的磷酸化信號(hào)。
 

5.成像：完成了以上所有工作，到了最后檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵步驟--成像。成像時(shí)，底物需要現(xiàn)配現(xiàn)用，配制時(shí)更要注意避光及兩種溶液的充分混合，注意實(shí)驗(yàn)的每一個(gè)細(xì)節(jié)才是實(shí)驗(yàn)立于不敗之地的王道。蛋白的磷酸化水平的變化是一些調(diào)控的主要方式，而這些差異變化往往是很細(xì)微的，需要精確的檢測(cè)才能準(zhǔn)確的闡述這一調(diào)控過程。選擇一個(gè)靈敏的檢測(cè)設(shè)備，幫您完成最后的檢測(cè)工作。

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• - Darq-9深度制冷CCD相機(jī)，-90℃，暗電流低至0.0001e/p/s，避免了背景對(duì)微弱信號(hào)的干擾。即使曝光30min或更長(zhǎng)時(shí)間，也沒有任何背景噪音干擾；

• - 多種像素整合方式，最高12x12的像素整合，極大的提高靈敏度，尤其適合蛋白的磷酸化檢測(cè)；

• - 多種成像模式，兼容化學(xué)發(fā)光和熒光成像，最多可以升級(jí)7通道的熒光成像。用戶可以輕松完成磷酸化蛋白等重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程或涉及多個(gè)蛋白的復(fù)雜調(diào)節(jié)過程；

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