PCR法檢測新冠等病毒DNA/RNA的熒光探針
今天，百螢為大家介紹使用PCR來對病毒DNA/RNA進行標記、定量、檢測的熒光探針。在臨床分子診斷中，核酸擴增檢測法，例如“逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應（RT-PCR）”可以用來早期檢測和鑒定由逆轉(zhuǎn)錄病毒引起的傳染病。RT-PCR以mRNA為起始模板，可在體外快速轉(zhuǎn)錄、擴增和檢測逆轉(zhuǎn)錄病毒的遺傳物質(zhì)。核酸檢測已成功用于檢測大多數(shù)逆轉(zhuǎn)錄病毒，包括流感病毒，腸病毒，冠狀病毒，埃博拉病毒和HIV。
逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應（RT-PCR）
逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）是檢測和定量mRNA表達水平的高度靈敏技術。在RT-PCR中，使用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA模板逆轉(zhuǎn)錄為互補DNA（cDNA）。然后使用標準PCR程序（變性，退火和延伸）將cDNA用作擴增模板。RT-PCR可用于多種應用，包括基因表達分析，微陣列，病原體檢測和疾病研究。
表1.RNA定量試劑/試劑盒
| 產(chǎn)品名稱 | Ex（nm） | Em（nm） | 規(guī)格 | 貨號 |
| StrandBrite 綠色熒光RNA定量試劑盒*高選擇性* | 490nm | 540nm | 100 Tests | 17657 |
| StrandBrite 綠色RNA定量試劑 | 490nm | 525nm | 1ml | 17610 |
| 10ml | 17611 | |||
| Portelite 熒光RNA定量試劑盒 | 490nm | 525nm | 100 Tests | 17658 |
| 500 Tests | 17659 |
RT-PCR定量方法及產(chǎn)品
RT-PCR產(chǎn)物的定量方法通�？煞譃閮深悾航K點RT-PCR和實時PCR。終點RT-PCR常用來測量少量樣品中的基因表達變化，而實時RT-PCR已成為在全球范圍內(nèi)驗證基因表達變化的標準方法。
1.終點RT-PCR
終點RT-PCR是在完成最后一個PCR循環(huán)后對PCR產(chǎn)物進行的分析。 用于定量終點RT-PCR的通用測量方法要求通過使用熒光染料（例如溴化乙錠EB）或P32標記的PCR產(chǎn)物的定量來檢測基因表達水平。 終點RT-PCR可用于通過三種不同方法測量表達水平的變化：相對，競爭和比較。
表2.終點RT-PCR檢測方法
| 終點RT-PCR | 特點 |
| 相對RT-PCR |
|
| 競爭性RT-PCR |
|
| 比較RT-PCR |
|
2.實時RT-PCR
實時PCR（RT-PCR）使用熒光報告分子來可靠地檢測在PCR過程的每個循環(huán)中生成的產(chǎn)物。（隨著反應的進行，由于每個擴增循環(huán)中PCR產(chǎn)物的積累，熒光增加。）。這些熒光報告分子包括結(jié)合到雙鏈DNA的染料（例如Cyber Green ）或序列特異性探針（例如Molecular Beacons）。
2.1使用DNA結(jié)合染料的非特異性檢測
在實時PCR中，DNA結(jié)合染料被用作熒光報告基因，以實時檢測PCR反應。隨著產(chǎn)物在每個連續(xù)的擴增循環(huán)中的積累，報告染料的熒光增強。記錄每個循環(huán)的熒光發(fā)射量，可以檢測指數(shù)期的PCR反應。 Cyber Green 是一種敏感的雙鏈DNA特異性染料，針對實時RT-PCR進行了優(yōu)化。在溶液中，未與DNA結(jié)合的染料幾乎沒有熒光。當染料與雙鏈DNA結(jié)合時，熒光會大大增強。與市面常見的SYBR Green相比，Cyber Green一般較少抑制RT-PCR也不太可能導致非特異性擴增。Cyber Green可以在更高的染料濃度高中，產(chǎn)生更強的PCR信號。較高的Cyber Green濃度允許用于qPCR消除“染料再分配”的問題。盡管雙鏈DNA結(jié)合染料為實時PCR提供了最方便，最便宜的選擇，但它有一個很明顯的缺點是特異性和非特異性產(chǎn)物均會產(chǎn)生信號。
表3.DNA結(jié)合染料
| 產(chǎn)品名稱 | Ex（nm） | Em（nm） | 規(guī)格 | 貨號 |
| Cyber Green 核酸凝膠染料 [相當于SYBR®Green] * 20X水性PCR溶液* | 498nm | 522nm | 5 x 1 mL Tests | 17591 |
| 1ml | 17592 | |||
| Cyber Green 核酸凝膠染料[相當于SYBR®Green] | 498nm | 522nm | 100ul | 17604 |
| 1ml | 17590 | |||
| Cyber Green 核酸凝膠染料 | 498nm | 522nm | 1ml | TJ1700 |
| Peko Green雙鏈核酸凝膠染料 | 502nm | 523nm | 1ml | TJ1701 |
| Cyber Gold核酸凝膠染料 | 300nm | 539nm | 500ul | TJ1702 |
| Cyber Safe DNA 凝膠電泳染料 | 280nm | 530nm | 500ul | TJ1703 |
| JJ Green 核酸凝膠染料 | 497nm | 520nm | 500ul | TJ1704 |
| Ru Red 核酸凝膠染料 | 300nm | 605nm | 500ul | TJ1710 |
| JJ Red 核酸凝膠染料 | 518nm | 605nm | 500ul | TJ1705 |
2.2使用目標特異性FRET探針進行特異性檢測
分子信標是一個單鏈寡核苷酸序列，用兩個熒光團標記，并保持“發(fā)夾”狀結(jié)構(gòu)。在目標序列的存在下，它們會展開、結(jié)合并發(fā)出熒光。分子信標由四部分組成：
- Loop：由與靶序列互補的分子信標的18-30個堿基對區(qū)域組成。
- Stem：在環(huán)的兩個末端連接的是兩個相互互補的（5至7個核苷酸殘基）短寡核苷酸。
- 5'末端熒光團：在分子信標的5'末端共價連接有熒光染料。
- 3'末端淬滅劑：在分子信標的3'末端共價連接了一個非熒光猝滅劑。
2.2.1 Tide Fluor 寡核苷酸標記系列產(chǎn)品
Tide Fluor 染料經(jīng)過優(yōu)化，可用于FRET寡核苷酸和肽標記。我們的Tide Fluor 染料比香豆素，熒光素，羅丹明和花青等經(jīng)典標記染料具有更強的熒光性和更高的光穩(wěn)定性。它們是在不降低性能的情況下標記肽和寡核苷酸的最佳熒光染料。
表4.經(jīng)典熒光標記染料
|
表5.Tide Fluor 染料和光譜性質(zhì)
| Tide Fluor染料 | Abs（nm） | Em（nm） | ε 1 | Φ 2 | 260 nm處CF3 | 280 nm處的CF 4 |
| Tide Fluor 1 | 345 | 442 | 20000 | 0.95 | 0.246 | 0.187 |
| Tide Fluor 2WS | 502 | 525 | 75000 | 0.9 | 0.211 | 0.091 |
| Tide Fluor 2 | 500 | 527 | 75000 | 0.9 | 0.288 | 0.201 |
| Tide Fluor 3WS | 555 | 565 | 150000 | 0.105 | 0.079 | 0.079 |
| Tide Fluor 3 | 555 | 584 | 85000 | 0.85 | 0.331 | 0.201 |
| Tide Fluor 4 | 590 | 618 | 90000 | 0.91 | 0.489 | 0.436 |
| Tide Fluor 5WS | 649 | 664 | 250000 | 0.25 | 0.023 | 0.027 |
| Tide Fluor 6WS | 676 | 695 | 220000 | 0.18 | 0.111 | 0.009 |
| Tide Fluor 7WS | 749 | 775 | 275000 | 0.12 | 0.009 | 0.049 |
| Tide Fluor 8WS | 775 | 807 | 250000 | 0.08 | 0.103 | 0.109 |
- ε= 最大吸收波長處的消光系數(shù)（cm -1 M -1）
- Φ=水性緩沖液（pH 7.2）中的熒光量子產(chǎn)率
- 260 nm處的CF是校正因子，用于消除染料對260 nm處的吸光度的影響（用于寡核苷酸和核酸標記）
- 280 nm處的CF是校正因子，用于消除染料對280 nm處的吸光度的影響（用于肽和蛋白質(zhì)標記）
2.2.2 Tide Quencher 淬滅劑系列產(chǎn)品
DABCYL是用于開發(fā)各種FRET應用的染料，但對于較長波長的染料（例如熒光素，羅丹明和花青）的低淬滅效率限制了其在敏感的熒光FRET探針開發(fā)中的應用，另外，DABCYL的吸收光譜對環(huán)境比較敏感。AAT Bioquest已開發(fā)出耐用的Tide Quencher 系列產(chǎn)品，用于開發(fā)更長波長的FRET探針。Tide Quencher 染料是消除經(jīng)典淬滅劑限制的絕佳選擇。
Tide Quencher 染料的主要優(yōu)點：
- 探索其他淬滅劑無法實現(xiàn)的FRET應用。
- 多種反應形式便于自我構(gòu)建所需的FRET生物分子。
- 與所需的熒光供體完全匹配。
- 更低的價格和更好的性能。
表6.Tide Quencher 染料和光譜性質(zhì)
| Tide Quencher 系列染料 | Abs（nm） | ε | 260 nm時的CF | 280 nm時的CF |
| Tide Quencher 1 | 488 | 20,000 | 0.147 | 0.194 |
| Tide Quencher 2 | 512 | 21,000 | 0.100 | 0.120 |
| Tide Quencher 2WS | 515 | 21,000 | 0.100 | 0.120 |
| Tide Quencher 3 | 576 | 22,000 | 0.085 | 0.091 |
| Tide Quencher 3WS | 576 | 90,000 | 0.186 | 0.205 |
| Tide Quencher 4 | 604 | 23,000 | 0.146 | 0.183 |
| Tide Quencher 4WS | 604 | 90,000 | 0.149 | 0.136 |
| Tide Quencher 5 | 661 | 24,000 | 0.170 | 0.082 |
| Tide Quencher 5WS | 661 | 130,000 | 0.072 | 0.082 |
| Tide Quencher 6WS | 691 | 130,000 | 0.120 | 0.102 |
| Tide Quencher 7WS | 759 | 140,000 | 0.072 | 0.091 |
2.2.3 Covidyte 肽底物系列產(chǎn)品
Covidyte系列產(chǎn)品是AAT Bioquest針對COVID-19最新研發(fā)的肽底物，用于通過FRET檢測冠狀病毒蛋白酶的強度。該系列產(chǎn)品為尋找冠狀病毒蛋白酶抑制劑提供了高靈敏的熒光信號強度。
表7.Covidyte 肽底物
| 產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 | Ex(nm) | Em(nm) |
| Covidyte ED450 | 13537 | 100 Tests | 334 | 453 |
| Covidyte EN450 | 13535 | 100 Tests | 334 | 453 |
| Covidyte TF670 | 13541 | 100 Tests | 648 | 663 |
| Covidyte IF670 | 13542 | 100 Tests | 654 | 669 |
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