今天，我們比較了使用四種紅色熒光鈣指示劑Calbryte 590 AM，Rhod-2 AM，Rhod-3 AM和Rhod-4 AM在細(xì)胞內(nèi)的鈣相應(yīng)檢測結(jié)果。 我們使用FlexStation3多模式酶標(biāo)儀在染料染色的細(xì)胞上使用不同劑量的ATP測量動(dòng)力學(xué)響應(yīng)。與Rhod-3不同，Calbryte 590 AM所需的清洗次數(shù)更少，并且可以在不用丙磺舒作為有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑的情況下使用。更長的保留時(shí)間和最小的滲漏屬性，使Calbryte 590可用于活細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺水平的中/高通量分析。

材料和方法

• 96孔板（黑色透明底，Greiner Bio-one）
• FlexStation3（分子設(shè)備）
• Calbryte 590 AM（AAT Bioquest，#20702）
• Rhod-4 AM（AAT Bioquest，#21120）
• Rhod-3 AM（ThermoFisher，#R10145）
• Rhod-2 AM（AAT Bioquest，#21060）
• PLURONIC ^® F-127（AAT Bioquest，#20053）
• 丙磺舒（#20061）
• 熒光顯微鏡（Keyence）

細(xì)胞培養(yǎng)

將倉鼠卵巢-CHO-K1細(xì)胞在黑色96孔板中于含10％FBS和青霉素-鏈霉素混合物的Ham's F-12培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。

鈣染料負(fù)載和細(xì)胞刺激

細(xì)胞加載用5μM鈣染料（Calbryte-590 AM，RHOD-2 AM，RHOD-3 AM或RHOD-4 AM）在培養(yǎng)基中的Pluronic ^® F-127（PF-127）和丙磺舒（PBC）在37°C的恒溫箱中培養(yǎng)60分鐘。洗去染料加載溶液，并將200 µLHanks和20 mM Hepes緩沖液（HH緩沖液）PBC加入板中，并在室溫下孵育30分鐘。將各種劑量的ATP溶液（5X工作溶液）添加到FlexStation3加載室中，并以50 µL的濃度添加到所需的孔中，以達(dá)到指示的最終濃度（0-10 µM，3X系列稀釋液）。在裝有PBC的HH緩沖液中的未加載細(xì)胞的孔中獲得背景熒光。

儀器設(shè)定

結(jié)果與討論

為了研究哪種紅色Ca²⁺染料在96孔板測定中表現(xiàn)最佳，將CHO-K1細(xì)胞加載了Calbryte 590 AM，Rhod-2 AM，Rhod-3 AM和Rhod-4 AM并用ATP處理刺激P2Y信號，并監(jiān)測Ca²⁺水平的細(xì)胞內(nèi)變化。如圖1A所示，Calbryte 590在ATP刺激下表現(xiàn)出最高的信號/背景比，其次是Rhod-4 ，Rhod-3和Rhod-2。

向該測定中添加丙磺舒的目的是通過抑制有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來使染料泄漏最小化。我們在沒有丙磺舒的情況下進(jìn)行了整個(gè)測定，并觀察到Calbryte 590在不犧牲信號/背景比的情況下表現(xiàn)最佳。（圖1和圖2）。

圖1.在存在丙磺舒（左）和不存在丙磺舒（右）的情況下進(jìn)行Ca2+檢測測定，并使用Ex / Em = 540/590的FlexStation3測量了570 nm的截止波長。

圖2.熒光成像：在沒有丙磺舒的情況下進(jìn)行Ca²⁺檢測測定，并使用TRITC濾光片組使用熒光顯微鏡測量響應(yīng)。

總結(jié)

在96孔板中研究CHO-K1細(xì)胞中P2Y1介導(dǎo)的Ca²⁺信號傳導(dǎo)方面，Carbyte 590和Rhod-4 AM比Rhod-3 AM更好。高性能可用于高通量分析活細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺的水平測定。