等溫擴增技術作為一種核酸分子診斷技術，從誕生之日起就不斷受到研究者的青睞，但也少不了質(zhì)疑，甚至摒棄。引起這種截然相反的態(tài)度的原因在于等溫擴增技術自身所存在的缺陷。而最為突出的一點是，在建立方法或者實際樣本檢測的過程中，等溫擴增技術引起假陽性結果的概率相對較高，使得其實際應用范圍變窄，未能真正顯示出其檢測優(yōu)勢。因此，推出這經(jīng)驗篇來回答“當?shù)葴財U增出現(xiàn)假陽性時應該如何應對？”。

01假陽性現(xiàn)象  

假陽性是指檢測陰性材料得到陽性結果。如果一次實驗中的幾個陰性對照中出現(xiàn)一個或幾個陽性結果，提示本次實驗中其它標本的檢測結果可能有假陽性。實驗中設立的陰性對照可提示有無假陽性結果出現(xiàn)。

02  造成假陽性的原因  

1. 樣品間交叉污染：樣本污染主要有收集樣本的容器被污染，或樣本放置時，由于密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有樣本而造成相互間交叉污染；樣本核酸模板在提取過程中，由于吸樣*污染導致標本間污染； 

2. 擴增產(chǎn)物污染：這是反應中最主要最常見的污染問題。因為擴增產(chǎn)物拷貝量大，所以極微量的產(chǎn)物污染，就可形成假陽性。

3. 氣溶膠污染：在空氣與液體面摩 擦時就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應管，開蓋時、吸樣時及污染進樣*的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計算一個氣溶膠顆粒可含48000拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題。 

4. 實驗室中克隆質(zhì)粒的污染：由于克隆質(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力，其污染可能性也很大。在分子生物學實驗室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對照的檢驗室，這個問題比較常見。 

03  假陽性問題的試驗控制  

在擴增檢測時，可設立陰性對照樣品和陽性對照樣品。陰性對照樣品檢測為陰性時，表明試驗全部過程的試劑沒有受到污染；陽性對照樣品檢測為陽性時，表明DNA提�。≧NA提取、RNA反轉錄）、DNA擴增和電泳鑒定工作體系正常。在陰性對照樣品和陽性對照樣品檢測結果成立的前提下，才能對檢測樣品進行判定。只有設立試驗全程的對照，才能證明試驗結果成立。 

造成假陰性的原因可以通過設置試驗對照來查找。

試驗對照包括： 

1、DNA陽性對照：以含有目的片段的DNA(或質(zhì)粒）作為模板進行擴增，證明試劑是否有效、擴增過程是否正確及待測樣品中是否含有目的片段。（注意：陽性樣品擴增效率高，應嚴格控制，避免其成為潛在的污染源）。

2、DNA陰性對照：以不含有目的片段的陰性樣品作為模板進行擴增，用于證明擴增過程中無假陽性現(xiàn)象。

3、空白對照：以純水作為模板進行擴增，用于證明擴增過程中無假陽性現(xiàn)象。

4、等溫擴增抑制物對照：在與陽性對照相同的反應體系中，加入相同數(shù)量的待測樣品DNA，如果未擴增出目的片段，證明此待測樣品DNA中存在擴增抑制物。 

5、空白提取對照：空白提取對照擴增結果為陽性，說明DNA提取試劑可能受到污染。 

6、陽性提取對照：陽性提取對照擴增結果為陰性，說明提取過程可能有誤。 如果DNA陽性對照擴增結果為陰性，或者DNA陰性對照和空白對照擴增結果為陽性，則說明PCR試劑或擴增過程存在問題。 

04  假陽性解決途徑  

由于擴增的敏感性和效率特別高，所以少量的擴增產(chǎn)物污染標本或反應管即可出現(xiàn)假陽性。尤其是擴增產(chǎn)物和質(zhì)粒分子很容易造成實驗室的污染，導致假陽性現(xiàn)象發(fā)生。 

1、規(guī)范實驗室設計 

實驗室設置上分配液區(qū)、DNA提取區(qū)、擴增區(qū)、電泳區(qū)。物流應按分配液區(qū)、模板提取區(qū)、擴增區(qū)、電泳區(qū)順序，嚴禁倒流。在連續(xù)而獨立的空間中完成不同實驗步驟。不同工作區(qū)域相互隔離，通過傳遞倉傳遞。 

2、規(guī)范試劑耗材管理 

1）驗證：新買的試劑需進行實驗前驗證； 

2）分裝：雙蒸水、引物和dNTP均應分裝儲存，并標明日期，以防污染；試劑的分裝應在裝有紫外燈的超凈工作臺上進行；試劑分裝成小份一次使用后棄去。 

3）消毒：除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應高壓消毒。必要時，在加樣本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。 

3、規(guī)范實驗室操作 

1）控制污染源：擴增產(chǎn)物和質(zhì)粒操作空間是最大的污染源，應嚴格防止將這個空間的物品帶出；

2）一次性用具：使用實驗服和一次性手套，使用帶有濾膜的移液器*頭，一次性反應管和離心管； 

3）定期消毒：定期對實驗室進行紫外照射，用10%漂白劑、3％雙氧水或?qū)Ｓ蒙虡I(yè)產(chǎn)品清理實驗室臺面及死角。 

4）定期通風：對實驗室定期進行正壓、負壓通風處理；

5）小心操作：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣*內(nèi)或濺出離心管外；加樣時，最后加陽性對照。 
 

05 面對實驗的假陽性個人建議  

1、端正心態(tài)，堅持不懈地探索。

2、引物設計要過關。

3、關注Bst DNA聚合酶的選擇和質(zhì)量。

4、關注dNTPs的質(zhì)量。dNTPs建議分裝保存在-20℃。低質(zhì)量的dNTPs不僅導致陽性擴增效率下降，還能引起非特異性擴增，即假陽性結果。

5、關注引物的質(zhì)量。如果是引物質(zhì)量引起的假陽性。

解決的對策有：

（1）提高純化級別至HPLC，以排除引物干粉摻雜物對體系的影響；

（2）選擇質(zhì)量過硬的合成機構；

（3）嚴格遵循引物保存的條件：干粉和高濃度引物液-20℃可保存數(shù)月；非干粉和工作濃度引物液4℃保存不超過一周。

6、優(yōu)化反應體系。對于等溫擴增技術而言，優(yōu)化反應體系是解決假陽性擴增最為直接、有效的方法。當然，在進行體系優(yōu)化前，要保證所有體系成分都不會引起假陽性。換言之，要確認好是反應體系配方引起的假陽性。

7、樣本成分耐受性影響。在建立等溫擴增技術時我們往往會忽略實際樣本成分給擴增帶來的影響。由于實際樣本絕非是純的核酸樣本，縱使用最好的純化試劑盒，部分樣本成分仍然會出現(xiàn)在最終提取液中。這些樣本成分包括尿素、尿酸、血清、血清、膽汁酸等，在等溫擴增時會使陽性反應速率變慢，誘發(fā)假陽性擴增或假陰性結果。因此，一個好的檢測試劑盒，必須對一定量的樣本成分有很好的耐受性。建議在方法構建好之后，進行實際樣本檢測或者模擬實際樣本檢測等實驗。

04 總結  

上述建議并非是解決假陽性問題的黃金鑰匙，可做大家參考。相信其他從事等溫擴增研究的人也都有其解決假陽性問題的經(jīng)驗與方法。彼此經(jīng)驗共享對于等溫擴增研究領域的健康發(fā)展是至關重要的。如果你恰巧有這方面的經(jīng)驗或者問題，不妨關注我們公眾號告知我們，我們會將經(jīng)驗共享于大家，將問題與大家一起探討，讓彼此也少走些彎路。