1.技術背景

  米酵菌酸（Bongkrekic acid，BA）是由椰毒假單胞菌屬酵米面亞種產(chǎn)生的一種可以引起食物中毒的呼吸系統(tǒng)性毒素。其結構如下圖所示，它是一種脂溶性酸性化合物，主要產(chǎn)生于谷類發(fā)酵制品、變質(zhì)椰子食品及鮮銀耳類產(chǎn)品中，有著比氰化物更強的生物毒性，攝入受其污染的食物會引發(fā)中毒，嚴重可致死亡。

目前市面上常用方法以及國標規(guī)定方法為固相萃取柱凈化和液液萃取的凈化方法，可能會面臨操作復雜、有機試劑消耗大、干擾多、回收率低等問題，Pribolab技術研發(fā)中心基于現(xiàn)有的標準方法的不足和局限性，建立了多功能凈化柱“一步法”凈化，可用于液相色譜二極管陣列檢測器或液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測食品中的米酵菌酸殘留，具有前處理簡單快速、環(huán)保低有機試劑消耗、回收率高，凈化效果好的特點，適用于各類食品基質(zhì)中米酵菌酸的測定。

2.實驗方法

參考食品安全國家標準-食品中米酵菌酸的測定（GB 5009.189-2016），優(yōu)化前處理方法，使其適用于“一步法”快速高效凈化。

2.1實驗試劑耗材

Pribolab® 500μg/mL米酵菌酸標準物質(zhì)（乙腈）

Pribolab®·ODS·C18 液相色譜柱

PriboFast® MFC 335多功能凈化柱

PriboFast玻璃纖維濾紙

乙腈水提取液：量取84 mL乙腈用水定容至100 mL，混勻備用。

2.2樣品制備與提取

干試樣經(jīng)粉碎過篩，濕試樣經(jīng)充分均質(zhì)，稱取25.0g試樣置于錐形瓶中，加入100mL乙腈水提取液，混勻，超聲提取30min，5000 r/min離心5分鐘或用玻璃纖維濾紙過濾，待凈化。

2.3試樣的凈化

取8mL上清液加入透明玻璃管中，使液體通過PriboFast® 335多功能凈化柱完成凈化。取凈化后的溶液過濾膜后上液相或液質(zhì)分析。

3.液相液質(zhì)條件

液相色譜條件	液相質(zhì)譜條件
色譜柱：Pribolab真菌毒素專用色譜柱C18(4.6*250 mm,5 μm)	Pribolab真菌毒素專用色譜柱C18（2.1*100 mm,1.8 μm）
流動相：甲醇+水（1%乙酸）=80:20	0.1%甲酸水-乙腈梯度洗脫
柱溫：30℃	30℃
進樣量：20μL	1μL
流速：1ml/min	0.3μL/min
檢測器：267nm	ESI-MRM，負離子模式

4.實驗結果

4.1實驗譜圖

圖1 米酵菌酸液相色譜圖

          圖2米酵菌酸液質(zhì)TIC圖

4.2結果分析

米酵菌酸結構式含有3個羧基（-COOH），酸性較強，容易丟失質(zhì)子而帶上負電荷，其保留因子和選擇性受pH值影響大，當流動相條件為酸性時可避免離子化從而得到對稱色譜峰。因此液相色譜采用甲醇+1%乙酸水（80:20）為流動相，分離效果好，方法檢出限為0.2μg/g。在液質(zhì)檢測中0.1%甲酸水-乙腈為流動相，同樣酸性環(huán)境抑制了米酵菌酸的電離，使其以分子形式存在，在反向固定相中的保留增強，且減少了與固定相中殘存硅醇基的結合，有助于改善峰型，方法檢出限0.1μg/kg。

 本次實驗選取了常被米酵菌酸污染的食品酸湯子、米粉、銀耳進行加標實驗驗證，加標水平2 mg/kg,每種加標做6個平行。結果如下表所示。

	米粉	銀耳	酸湯子
平均回收率(%)	88.77	92.46	83.41
相對標準偏差（%）	3.8	2.4	3.1

 

5.結論

本實驗建立多功能凈化柱“一步法”凈化食品中的米酵菌酸，具有前處理簡單高效，回收率高的特點，適用于液相以及液質(zhì)方法檢測米酵菌酸殘留，對食品風險監(jiān)測和相關標準的制定具有指導意義。