細胞轉(zhuǎn)染技巧及常見問題分析
1. Freestyle™ 293-F細胞的培養(yǎng)：在37℃，125rpm，8% CO2的搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染當天Freestyle™ 293-F細胞密度達到1.5-2.5×106個/ml時可以進行轉(zhuǎn)染，但細胞存活率需>95%；可以使用生產(chǎn)的臺盼藍染色細胞存活率檢測試劑盒(C0011)進行細胞存活率檢測。
2. 以50ml懸浮培養(yǎng)的Freestyle™ 293-F細胞為例，取兩個潔凈無菌離心管，分別加入1.25ml不含抗生素和血清的Freestyle™ 293-F細胞培養(yǎng)液；然后其中一管加入50μg質(zhì)粒DNA，另一管加入100μl Lipo293F™轉(zhuǎn)染試劑，分別用移液器輕輕吹打混勻，請?zhí)貏e注意不可Vortex或離心。將含有DNA的培養(yǎng)液用槍輕輕加入含Lipo293F™轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)液中，輕輕顛倒離心管或者用槍輕輕吹打混勻，室溫靜置15分鐘(室溫存放6小時內(nèi)穩(wěn)定)。
| 轉(zhuǎn)染體系體積 | 10ml | 20ml | 50ml | 100ml | 200ml | 500ml |
| Lipo293F™轉(zhuǎn)染試劑 | 20μl | 40μl | 100μl | 200μl | 400μl | 1ml |
| Freestyle™ 293-F細胞培養(yǎng)液 | 0.25ml | 0.5ml | 1.25ml | 2.5ml | 5ml | 12.5ml |
| DNA | 10μg | 20μg | 50μg | 100μg | 200μg | 500μg |
| Freestyle™ 293-F細胞培養(yǎng)液 | 0.25ml | 0.5ml | 1.25ml | 2.5ml | 5ml | 12.5ml |
| 單獨稀釋好的Lipo293F™轉(zhuǎn)染試劑和DNA，混勻并室溫靜止放置15分鐘， 隨后加入到培養(yǎng)的懸浮細胞中繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時，后續(xù)進行目的蛋白的檢測和純化。 | ||||||
3. 把2.5ml Lipo293F™轉(zhuǎn)染試劑-DNA混合物全部加入到50ml懸浮培養(yǎng)的Freestyle™ 293-F細胞中。由于青霉素/鏈霉素雙抗可能影響重組蛋白的表達，通常不建議在細胞轉(zhuǎn)染時加入雙抗；如細胞培養(yǎng)環(huán)境容易發(fā)生污染，可酌情加入1/5常規(guī)用量的雙抗。
4. Freestyle™ 293-F細胞在37℃，125rpm，8% CO2的搖床培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時后，即可收集細胞進行目的蛋白的檢測和純化。
常見問題：
1. 轉(zhuǎn)染效率低：
a. 優(yōu)化質(zhì)粒與Lipo293F™轉(zhuǎn)染試劑比例，有必要是可以適當嘗試加大質(zhì)粒用量。
b. 應(yīng)使用高純度、無菌、無污染物的質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染，DNA純度方面A260/A280比值要接近1.8通常宜控制在1.8-1.9范圍內(nèi)，偏低則有可能有蛋白污染，偏高則有可能有RNA污染�？梢允褂蒙a(chǎn)的質(zhì)粒大量抽提試劑盒(D0026)進行抽提，以保證可以獲得較高的轉(zhuǎn)染效率。
c. 需用無抗生素和無血清培養(yǎng)液配制Lipo293F™轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒的混合物。
d. 轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)時間不足，而被誤認為轉(zhuǎn)染效率偏低。懸浮狀態(tài)下的Freestyle™ 293-F細胞轉(zhuǎn)染后至顯著表達所需培養(yǎng)時間通常為48-72小時。
e. 檢查細胞是否有支原體感染，支原體感染會影響細胞增殖，并很可能影響轉(zhuǎn)染效率。
f. 如果沒有檢測到目的蛋白表達，應(yīng)該仔細核對轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的測序結(jié)果，確保測序結(jié)果和讀碼框完全正確。
g. 檢查轉(zhuǎn)染時細胞密度是否過高。
2. 細胞毒性較明顯：
a. 目的基因的表達蛋白有毒性。此時可以和空載體轉(zhuǎn)染效果比較，以確定是否是目的基因蛋白表達對細胞產(chǎn)生毒性。如果確定有細胞毒性，可以考慮適當減少質(zhì)粒用量，并按照比例減少Lipo293F™轉(zhuǎn)染試劑。
b. 檢查轉(zhuǎn)染時細胞密度是否太低。
c. 檢查細胞是否有支原體等微生物污染。
附錄：
常用多孔板和培養(yǎng)皿的尺寸、培養(yǎng)面積、細胞培養(yǎng)量和推薦的培養(yǎng)體積等相關(guān)數(shù)據(jù)表：
| Multiple Well Plates or Dishes | Single Well Only for Plates | |||||
| Diameter (Bottom, mm)* | Growth Area (cm2)* | Average Cell Yield | Total Well Volume (ml) | Working Volume (ml) | Recommended Volume (ml) | |
| 6 well | 34.8 | 9.5 | 9.5 × 105 | 16.8 | 1.9-2.9 | 2 |
| 12 well | 22.1 | 3.8 | 3.8 × 105 | 6.9 | 0.76-1.14 | 1 |
| 24 well | 15.6 | 1.9 | 1.9 × 105 | 3.4 | 0.38-0.57 | 0.5 |
| 48 well | 11.0 | 0.95 | 9.5 × 104 | 1.6 | 0.19-0.285 | 0.25 |
| 96 well | 6.4 | 0.32 | 3.2 × 104 | 0.36 | 0.10-0.20 | 0.1 |
| 384 well | 2.7 | 0.056 | 5.6 × 103 | 0.112 | 0.025-0.050 | 0.030 |
| 1536 well | 1.63 × 1.63** | 0.025 | 2.5 × 103 | 0.0125 | 0.005-0.010 | 0.010 |
| 3.5 cm dish | 34 | 9 | 9.0 × 105 | NA | 1.8-2.7 | 2 |
| 6 cm dish | 52 | 21 | 2.1 × 106 | NA | 4.2-6.3 | 5 |
| 10 cm dish | 8.4 | 55 | 5.5 × 106 | NA | 11-16.5 | 12 |
| 15cm dish | 14 | 152 | 1.5 × 107 | NA | 30.4-45.6 | 35 |
| 24.5cm dish | 22.4 × 22.4** | 500 | 5.0 × 107 | NA | 100-150 | 120 |
*Diameter and growth area may vary depending on the manufacturer, and the listed sizes are from Corning.
**These wells or dishes are square.
