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標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞冷凍、解凍方法指南-–實(shí)現(xiàn)重現(xiàn)性更高的細(xì)胞復(fù)蘇結(jié)果
摘要
在細(xì)胞研究和生產(chǎn)的各個(gè)領(lǐng)域，將冷凍的細(xì)胞解凍是一項(xiàng)必不可少的操作，但在一些情況下這一操作要素被低估了。超低溫保存過(guò)程的標(biāo)準(zhǔn)化 — 包括標(biāo)準(zhǔn)化的細(xì)胞解凍方案 — 有助于最大限度地保證細(xì)胞凍存效果，從而獲得既可重現(xiàn)又可靠的結(jié)果。
內(nèi)容概覽
> 簡(jiǎn)介
> 如何解凍細(xì)胞
> 細(xì)胞解凍方法
> 選擇解凍方法前的注意事項(xiàng)
> 總結(jié)
簡(jiǎn)介
在細(xì)胞生物學(xué)中，細(xì)胞的冷凍和解凍一直是其中一項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。這一過(guò)程也被稱為超低溫保存，能夠有效地停止細(xì)胞衰亡，因?yàn)檫@一過(guò)程允許幾乎近似的細(xì)胞批次在數(shù)月、數(shù)年甚至數(shù)十年之后使用（圖 1），可大幅提高在不同時(shí)間進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性，還有助于節(jié)省時(shí)間、資源和成本 [1]。
圖 1： 二級(jí)細(xì)胞庫(kù)系統(tǒng)概要示意圖：建立主細(xì)胞庫(kù)和工作細(xì)胞庫(kù)，包括最低傳代所需細(xì)胞的超低溫保存，是一種良好的細(xì)胞培養(yǎng)方法
在整個(gè)冷凍 - 儲(chǔ)存 - 解凍過(guò)程中，面臨的一項(xiàng)關(guān)鍵性挑戰(zhàn)是確保高細(xì)胞存活率，或許更重要的是確保超低溫保存細(xì)胞行為的可預(yù)測(cè)性和重現(xiàn)性。為此，人們制定了許多不同的指導(dǎo)方針和方案。
在超低溫保存過(guò)程中，造成細(xì)胞死亡的主要原因是胞內(nèi)冰晶的形成。以錯(cuò)誤的方式冷凍時(shí)，會(huì)在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶，這可能會(huì)損壞細(xì)胞膜和細(xì)胞器，從而大幅降低細(xì)胞恢復(fù)的可能性。
為了幫助防止形成胞內(nèi)冰晶，每個(gè)細(xì)胞冷凍方案都有兩項(xiàng)基本要求。第一項(xiàng)基本要求是在冷凍劑中加入低溫保護(hù)劑，二甲亞砜(DMSO) 或甘油等化合物會(huì)穿透細(xì)胞膜，這通常會(huì)降低培養(yǎng)基的凝固點(diǎn)和玻璃轉(zhuǎn)換溫度，從而防止在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶 [2,3]。
在超低溫保存過(guò)程中，造成細(xì)胞死亡的主要原因是胞內(nèi)冰晶的形成。以錯(cuò)誤的方式冷凍時(shí)，會(huì)在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶，這可能會(huì)損壞細(xì)胞膜和細(xì)胞器，從而大幅降低細(xì)胞恢復(fù)的可能性。
為了幫助防止形成胞內(nèi)冰晶，每個(gè)細(xì)胞冷凍方案都有兩項(xiàng)基本要求。第一項(xiàng)基本要求是在冷凍劑中加入低溫保護(hù)劑，二甲亞砜(DMSO) 或甘油等化合物會(huì)穿透細(xì)胞膜，這通常會(huì)降低培養(yǎng)基的凝固點(diǎn)和玻璃轉(zhuǎn)換溫度，從而防止在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶 [2,3]。
第二項(xiàng)要求是緩慢冷卻。在 4 到 –70 °C 之間的臨界溫度范圍內(nèi)，以每分鐘 1 °C 的速率冷卻細(xì)胞懸液通常被視為最適宜于細(xì)胞存活，無(wú)論是哪種細(xì)胞類型 [3]。這是因?yàn)�，以較慢的速度冷卻細(xì)胞可確保首先在細(xì)胞外部形成低溶質(zhì)冰晶，從而增加剩余培養(yǎng)基中的溶質(zhì)濃度，并在滲透作用下排出細(xì)胞。這反過(guò)來(lái)可減少細(xì)胞內(nèi)形成的冰晶 [3]。
在受控冷凍至至少 –70 °C 的溫度后，可將凍存管移入液氮儲(chǔ)存區(qū)（–150 至 –196 °C，圖 2）或在 –150 °C 下運(yùn)行的深低溫冰箱內(nèi)長(zhǎng)期保存 [4]。
圖 2： 建議使用液氮儲(chǔ)存區(qū)長(zhǎng)期儲(chǔ)存細(xì)胞。
有很多教科書(shū)和在線資源中都詳細(xì)介紹了幫助科學(xué)家實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化的可靠細(xì)胞冷凍的原理和步驟，但是對(duì)細(xì)胞解凍過(guò)程相關(guān)的注意事項(xiàng)幾乎沒(méi)有講解。下文概述了細(xì)胞解凍的原理，描述了不同的方法，并討論了改進(jìn)細(xì)胞解凍方案標(biāo)準(zhǔn)化的注意事項(xiàng)。
如何解凍細(xì)胞
冷凍細(xì)胞需要以緩慢而可控的速率進(jìn)行，但是將冷凍的細(xì)胞解凍時(shí)最好采用較快的速度。細(xì)胞周?chē)У南Р粫?huì)產(chǎn)生與冰晶形成相同的破壞效應(yīng)，因此最好盡快使細(xì)胞恢復(fù)到正常培養(yǎng)條件，以便（對(duì)于粘附細(xì)胞）能夠錨固在表面上。
典型的細(xì)胞解凍方案通常是從液氮儲(chǔ)存區(qū)中取出凍存管開(kāi)始。在這一步驟中，必須熟悉操作液氮的所有常見(jiàn)預(yù)防措施（圖 3）[5]。此外，如果凍存管未能正確密封并且儲(chǔ)存在液相中，則隨著時(shí)間的推移，液氮可能會(huì)滲入管中，導(dǎo)致在從液氮中取出后不久，管內(nèi)的壓力迅速增大 — 因此，務(wù)必佩戴適當(dāng)?shù)拿娌糠雷o(hù)裝置。
圖 3： 從液氮儲(chǔ)存區(qū)收集細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意防護(hù)。
圖片來(lái)源： Minerva Studio/shutterstock.com
圖片來(lái)源： Minerva Studio/shutterstock.com
接下來(lái)，必須將凍存管解凍。一個(gè)常用的經(jīng)驗(yàn)法則是，在一個(gè)含有 1 mL 細(xì)胞懸液的標(biāo)準(zhǔn)凍存管中開(kāi)始解凍細(xì)胞時(shí)，所有冰晶都會(huì)在幾分鐘內(nèi)消失，快速加熱可防止在解凍過(guò)程中出現(xiàn)局部再結(jié)晶，否則可能導(dǎo)致細(xì)胞損傷 [6]。
有時(shí)，由于尋找不同的凍存管所花費(fèi)的時(shí)間或由于液氮儲(chǔ)存區(qū)的位置等因素，無(wú)法在幾分鐘內(nèi)完成解凍。在這種情況下，將緩慢解凍和將細(xì)胞留在解凍的冷凍劑中超過(guò)所需的時(shí)間相比，那么凍存管置于盡可能低的溫度下然后快速解凍的做法更加可取 [7]。
當(dāng)所有的冰晶都消失后，需要盡量減小低溫保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞的任何進(jìn)一步的不利影響。有兩種方法可實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。首先，可以直接培養(yǎng)細(xì)胞，例如在方瓶中培養(yǎng)，同時(shí)確保用正常培養(yǎng)基將冷凍劑稀釋至少 10 倍�；蛘�，也可以用普通培養(yǎng)基稀釋冷凍劑，把試管離心，移除培養(yǎng)基，然后在新鮮培養(yǎng)基中重新培養(yǎng)細(xì)胞 [1,4,7]。
為了檢查細(xì)胞解凍方案是否成功，建議測(cè)定存活細(xì)胞的百分比（例如，使用臺(tái)盼藍(lán)染色法和細(xì)胞計(jì)數(shù)器） [8]。為了改善標(biāo)準(zhǔn)，最好持續(xù)幾天觀察培養(yǎng)液中的細(xì)胞形態(tài)或生長(zhǎng)速率有無(wú)任何異常。生長(zhǎng)不良或不一致可能表示細(xì)胞制備或超低溫保存過(guò)程中出現(xiàn)問(wèn)題，因此早期檢測(cè)可能有助于減少實(shí)驗(yàn)誤差。
有時(shí)，由于尋找不同的凍存管所花費(fèi)的時(shí)間或由于液氮儲(chǔ)存區(qū)的位置等因素，無(wú)法在幾分鐘內(nèi)完成解凍。在這種情況下，將緩慢解凍和將細(xì)胞留在解凍的冷凍劑中超過(guò)所需的時(shí)間相比，那么凍存管置于盡可能低的溫度下然后快速解凍的做法更加可取 [7]。
當(dāng)所有的冰晶都消失后，需要盡量減小低溫保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞的任何進(jìn)一步的不利影響。有兩種方法可實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。首先，可以直接培養(yǎng)細(xì)胞，例如在方瓶中培養(yǎng)，同時(shí)確保用正常培養(yǎng)基將冷凍劑稀釋至少 10 倍�；蛘�，也可以用普通培養(yǎng)基稀釋冷凍劑，把試管離心，移除培養(yǎng)基，然后在新鮮培養(yǎng)基中重新培養(yǎng)細(xì)胞 [1,4,7]。
為了檢查細(xì)胞解凍方案是否成功，建議測(cè)定存活細(xì)胞的百分比（例如，使用臺(tái)盼藍(lán)染色法和細(xì)胞計(jì)數(shù)器） [8]。為了改善標(biāo)準(zhǔn)，最好持續(xù)幾天觀察培養(yǎng)液中的細(xì)胞形態(tài)或生長(zhǎng)速率有無(wú)任何異常。生長(zhǎng)不良或不一致可能表示細(xì)胞制備或超低溫保存過(guò)程中出現(xiàn)問(wèn)題，因此早期檢測(cè)可能有助于減少實(shí)驗(yàn)誤差。
圖 4： 觀察解凍后培養(yǎng)液中細(xì)胞的形態(tài)是否異常。
正常(a)和異常(b)的細(xì)胞形態(tài)示例（Vero細(xì)胞， 10 x）
正常(a)和異常(b)的細(xì)胞形態(tài)示例（Vero細(xì)胞， 10 x）
下載“細(xì)胞配置文件”模板，清晰、一致地記錄培養(yǎng)的重要細(xì)節(jié)
細(xì)胞解凍方法
表 1.不同細(xì)胞解凍方法的優(yōu)缺點(diǎn)概覽
在實(shí)驗(yàn)室最常用的解凍冷凍細(xì)胞的方法可能是使用公用水浴槽（圖 4）。水具有良好的導(dǎo)熱性，可以保證快速加熱，同時(shí)也可以防止凍存管內(nèi)部局部過(guò)熱。水浴槽也是細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室日常使用的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)備的之一，因此無(wú)需額外的準(zhǔn)備或投資。
使用水浴槽或任何其他解凍方法加熱細(xì)胞時(shí)，切勿將細(xì)胞暴露在高于 37 °C 的溫度下。盡管加熱過(guò)程中的溫度總變化可能超過(guò) 200 °C，但如果管內(nèi)的局部溫度超過(guò) 37 °C，這會(huì)迅速誘發(fā)不良影響，甚至是細(xì)胞死亡 [9]。
然而，水浴槽的一個(gè)主要缺點(diǎn)是水和樣品接觸可能造成污染。由于水位、持續(xù)檢查凍存管的需要以及攪拌樣品以防止產(chǎn)生溫度梯度的要求，在解凍過(guò)程中很難保持凍存管頂部的干燥 [6]。
手動(dòng)加熱
通過(guò)手動(dòng)加熱凍存管將細(xì)胞解凍是一種廣受歡迎的方法，因?yàn)樗恍枰魏卧O(shè)備，主體溫度與水浴槽相似，而且使用戶能夠連續(xù)監(jiān)測(cè)并輕柔搖動(dòng)凍存管。但必須注意，與將凍存管浸沒(méi)在水中相比，傳熱效率要低得多，變數(shù)也很多，這使得手動(dòng)加熱凍存管的速度可能較慢，重現(xiàn)性也較低。
同時(shí)解凍兩個(gè)以上的凍存管時(shí)，手動(dòng)加熱也不實(shí)用，還會(huì)導(dǎo)致冷卻速率減慢。此外，將皮膚暴露在接近–196 °C 的溫度下，即使佩戴了丁腈手套也會(huì)造成嚴(yán)重傷害。出于這些原因，不建議進(jìn)行手動(dòng)加熱。
同時(shí)解凍兩個(gè)以上的凍存管時(shí)，手動(dòng)加熱也不實(shí)用，還會(huì)導(dǎo)致冷卻速率減慢。此外，將皮膚暴露在接近–196 °C 的溫度下，即使佩戴了丁腈手套也會(huì)造成嚴(yán)重傷害。出于這些原因，不建議進(jìn)行手動(dòng)加熱。
金屬珠浴恒溫箱
當(dāng)加熱細(xì)胞培養(yǎng)基或在培養(yǎng)箱外保持培養(yǎng)液的溫度時(shí)，可以使用金屬珠浴恒溫箱代替水浴槽。但是，與手動(dòng)加熱或空氣加熱（例如在培養(yǎng)箱中）類似，珠子并不具備水浴槽的高效傳熱能力，因?yàn)榕c容器接觸的表面積較小，導(dǎo)致無(wú)法可靠地或足夠快速地解凍細(xì)胞。通常情況下推廣使用珠浴恒溫箱，因?yàn)橹樵『銣叵洳恍枰獡Q水，但隨著時(shí)間的推移，灰塵和溢出物的積聚就需要清潔和重新安裝，以防止污染。
選擇解凍方法前的注意事項(xiàng)
實(shí)驗(yàn)室特有的注意事項(xiàng)
比較不同的細(xì)胞解凍方法時(shí)，不可避免地要考慮到許多實(shí)驗(yàn)室特有的注意事項(xiàng)。其中一個(gè)要注意的事項(xiàng)是在潔凈室進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)。在這種環(huán)境下，水浴槽可能成為空氣污染的來(lái)源，因此應(yīng)考慮采用替代方法 [10]。
影響解凍方法選擇的另一個(gè)具體情況是，在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室中工作時(shí)，需要記錄和跟蹤每一個(gè)工作步驟，或者需要保持恒定的加熱速率 [6,11]。當(dāng)然，在選擇使用現(xiàn)有設(shè)備或使用專用裝置進(jìn)行細(xì)胞解凍時(shí)，可用的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備預(yù)算具有關(guān)鍵性的影響。
影響解凍方法選擇的另一個(gè)具體情況是，在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室中工作時(shí)，需要記錄和跟蹤每一個(gè)工作步驟，或者需要保持恒定的加熱速率 [6,11]。當(dāng)然，在選擇使用現(xiàn)有設(shè)備或使用專用裝置進(jìn)行細(xì)胞解凍時(shí)，可用的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備預(yù)算具有關(guān)鍵性的影響。
專用裝置
在過(guò)去的十年中，一些制造商開(kāi)發(fā)了可以不使用水浴槽而實(shí)現(xiàn)所需的快速加熱解凍的專用裝置。大多數(shù)裝置都是專為凍存管設(shè)計(jì)的，當(dāng)然也有可以處理更大體積的系統(tǒng)。專用裝置可以設(shè)置程序執(zhí)行解凍過(guò)程。在對(duì)解凍過(guò)程的標(biāo)準(zhǔn)化和文檔化有更高要求的情況下，這將帶來(lái)許多好處。這些裝置也非常適合于不能實(shí)行水浴加熱的情況 [6]。專用解凍裝置最重要的缺點(diǎn)是需要前期投資。水浴槽解凍通常不需要額外的投資，而專用的解凍設(shè)備增加了細(xì)胞培養(yǎng)工作流的額外成本。另外，有些裝置一次只能解凍一個(gè)凍存管，導(dǎo)致可能與某些細(xì)胞培養(yǎng)方案不相容。
細(xì)胞解凍的標(biāo)準(zhǔn)化
不管選擇哪一種方法，標(biāo)準(zhǔn)化都會(huì)大幅改善結(jié)果 — 無(wú)論是在監(jiān)管環(huán)境下工作還是基礎(chǔ)研究。例如，保持一致的細(xì)胞存活率可以減少解凍過(guò)量細(xì)胞的需要，從而可確保擁有足夠的細(xì)胞儲(chǔ)備，當(dāng)細(xì)胞量較少時(shí)這就尤為重要。
方案標(biāo)準(zhǔn)化也會(huì)影響細(xì)胞在平板培養(yǎng)后的行為。例如，當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間暴露于 DMSO 時(shí)，一些類型的細(xì)胞更有可能發(fā)生分化 [12]。因此，冷凍或解凍方案的變化可能會(huì)導(dǎo)致超低溫保存后細(xì)胞表型的差異和結(jié)果的變化。
方案標(biāo)準(zhǔn)化也會(huì)影響細(xì)胞在平板培養(yǎng)后的行為。例如，當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間暴露于 DMSO 時(shí)，一些類型的細(xì)胞更有可能發(fā)生分化 [12]。因此，冷凍或解凍方案的變化可能會(huì)導(dǎo)致超低溫保存后細(xì)胞表型的差異和結(jié)果的變化。
細(xì)胞類型特定的注意事項(xiàng)
有許多冷凍和解凍方面適用于所有細(xì)胞類型，但必須注意，一些方面可能因某些細(xì)胞類型而異，因此應(yīng)盡可能使用適合特定細(xì)胞類型的解凍方案。許多商業(yè)細(xì)胞系已經(jīng)過(guò)全面的研究并且優(yōu)化了超低溫保存方案，但對(duì)于不常見(jiàn)的細(xì)胞類型，建議進(jìn)行文獻(xiàn)檢索或進(jìn)行小規(guī)模的優(yōu)化研究。
每種細(xì)胞類型的細(xì)胞解凍都各不相同，需要密切關(guān)注細(xì)胞恢復(fù)正常生長(zhǎng)和正常響應(yīng)刺激物所需的時(shí)間。例如，如果增殖速率是研究的一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)，很重要的一點(diǎn)是，不要從尚未完全從解凍過(guò)程中恢復(fù)的細(xì)胞開(kāi)始實(shí)驗(yàn) — 因?yàn)椴煌愋偷募?xì)胞之間可能存在較大差異。比如，當(dāng)測(cè)量特定蛋白的表達(dá)時(shí)，細(xì)胞需要完全恢復(fù)產(chǎn)生這種蛋白的能力 [7]。
總結(jié)每種細(xì)胞類型的細(xì)胞解凍都各不相同，需要密切關(guān)注細(xì)胞恢復(fù)正常生長(zhǎng)和正常響應(yīng)刺激物所需的時(shí)間。例如，如果增殖速率是研究的一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)，很重要的一點(diǎn)是，不要從尚未完全從解凍過(guò)程中恢復(fù)的細(xì)胞開(kāi)始實(shí)驗(yàn) — 因?yàn)椴煌愋偷募?xì)胞之間可能存在較大差異。比如，當(dāng)測(cè)量特定蛋白的表達(dá)時(shí)，細(xì)胞需要完全恢復(fù)產(chǎn)生這種蛋白的能力 [7]。
為了在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室獲得一致的結(jié)果，務(wù)必在細(xì)胞培養(yǎng)的每一步實(shí)現(xiàn)高水平的標(biāo)準(zhǔn)化。細(xì)胞解凍有多種不同的方法可供使用 — 在設(shè)定可靠數(shù)據(jù)和可靠產(chǎn)品的正確標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，選擇適合每種特定的細(xì)胞類型、實(shí)驗(yàn)室或應(yīng)用的細(xì)胞解凍方案是關(guān)鍵。
參考文獻(xiàn)
[1]https://www.lgcstandards-atcc.org/Documents/Marketing_Literature /Animal_Cell_Culture_Guide/Cryopreservation.aspx
[3] Oishi, K et al. Cryopreservation of Mouse Adipose Tissue-Derived Stem/Progenitor Cells.
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[4] https://www.lgcstandards-atcc.org/How_to_Revive_Cultures.aspx
[5] https://www.labmanager.com/lab-health-and-safety/keeping-cool-under-pressure-5552
[6] Hunt, CJ. Technical Considerations in the Freezing, Low-Temperature Storage and Thawing of Stem Cells for Cellular Therapies. Transfusion Medicine and Hemotherapy 2019; 46: 134–149.
[7] Baust, JM et al. Best practices for cryopreserving, thawing, recovering, and assessing cells.
In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal 2017.
[8] Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology 2019.
[9]https://www.biocompare.com/Editorial-Articles/358505-Cryopreservation-Freezing-Solutions
[10] https://www.news-medical.net/life-sciences/What-are-Cleanrooms.aspx
[11]https://www.bioprocessonline.com/doc/cell-thawing-are-you-risking-gmp-compliance-with-the-water-bath-method-0001
[12] Best, BP. Cryoprotectant Toxicity: Facts, Issues, and Questions. Rejuvenation Research 2015; 18(5): 422–436.
標(biāo)簽：
細(xì)胞解凍
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