CRISPR-Cas9是一項可對基因組特定靶基因進(jìn)行編輯的DNA操控技術(shù)，該系統(tǒng)由sgRNA和Cas9蛋白組成，Cas9蛋白在sgRNA的引導(dǎo)下對靶位點處的DNA雙鏈進(jìn)行剪切，并產(chǎn)生一個平末端的雙鏈DNA缺口，進(jìn)而啟動DNA損傷修復(fù)機(jī)制，通過非同源末端鏈接（Non-homologous end joining，NHEJ）或同源重組(Homologous recombination，HR）的方式將斷裂上下游兩端的序列連接起來。

目前，CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)在疾病基礎(chǔ)研究、靶點驗證、藥物分子的高通量篩選、以及遺傳性疾病的治療等領(lǐng)域得到了越來越廣泛的應(yīng)用。sgRNA在CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)中具有準(zhǔn)確識別靶基因序列的作用，其效果可影響編輯的效率、是否發(fā)生脫靶等，甚至對最終基因編輯的效果產(chǎn)生決定性作用。因此，設(shè)計合理有效的sgRNA是我們實現(xiàn)基因編輯的重要基礎(chǔ)。

sgRNA設(shè)計的一般流程如下：

圖1. sgRNA的設(shè)計流程

靶基因信息的分析
查詢靶基因信息常用的數(shù)據(jù)庫有NCBI、Ensembl等，在查詢過程中要注意物種的選擇和確定靶基因在數(shù)據(jù)庫中的登錄號，避免查找錯誤。查詢到目的基因信息后，需進(jìn)一步關(guān)注其所在基因座上下游基因情況、轉(zhuǎn)錄本數(shù)量、外顯子數(shù)量及長度、翻譯起始位點與終止位點等信息。然后再綜合考量上述信息進(jìn)行下一步的sgRNA設(shè)計。

此處以查詢?nèi)祟怰ag1基因為例。在NCBI Gene數(shù)據(jù)庫中輸入需要查找的人類Rag1基因，查找的結(jié)果顯示多個與Rag1相關(guān)的基因，這些基因包括了不同物種的Rag1同源基因。因而查找時需要注意該基因在NCBI的登錄號與種屬描述等（圖2a）。點擊查詢目的基因人類Rag1基因，顯示出該基因的基本信息。

可在“Download Datasets”下載該基因的相關(guān)序列。在“See related”可查看該基因在Ensembl數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)信息，主要是為了查看該基因的轉(zhuǎn)錄本相關(guān)信息（圖2b）。鏈接到Ensembl數(shù)據(jù)庫后能查找到該基因的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量等相關(guān)信息，此處顯示人類Rag1基因有三個轉(zhuǎn)錄本，并且可以打開任意一個轉(zhuǎn)錄本查看相關(guān)信息（圖2c）。查詢RAG1-201轉(zhuǎn)錄本信息，可打開左側(cè)“Exons”查看該轉(zhuǎn)錄本的外顯子等相關(guān)信息（圖2d），即可顯示該轉(zhuǎn)錄本的基本結(jié)構(gòu)（圖2e）。
 

圖2. 靶基因信息的分析

靶區(qū)域的選擇原則
以基因敲除（KO）為例，基因敲除可采用2種不同策略——移碼突變和片段敲除，雖然不同的策略對于靶區(qū)域選擇的參考標(biāo)準(zhǔn)有差異，但也需遵循以下原則：

1. 不影響其他基因，尤其是編碼蛋白的基因。挑選靶區(qū)域時避免選擇與其他基因重疊的區(qū)域（圖3a）。
2. 盡可能影響所有的轉(zhuǎn)錄本，敲除位點最好在編碼區(qū)的前50%，但避免敲除ATG所在的位置（圖3b）
3. 能影響蛋白的功能結(jié)構(gòu)域。

對于片段敲除，需考慮更多因素：如片段敲除所敲除的外顯子編碼序列之和為非3的倍數(shù)（圖3c），這樣可使靶區(qū)域后面的序列發(fā)生移碼，無法翻譯出功能蛋白，從而使敲除更徹底。片段敲除所選定的敲除區(qū)域不超過10Kb，超過10Kb后編輯效率會降低。片段敲除的gRNA設(shè)計在內(nèi)含子上，這樣能敲除整個外顯子區(qū)，避免翻譯出殘留蛋白。并且gRNA的設(shè)計位點需靠近所敲除的外顯子，這樣可避免產(chǎn)生不可控的剪切信號而導(dǎo)致形成新的轉(zhuǎn)錄本。敲除區(qū)域前后序列盡量簡單，方便后續(xù)的PCR鑒定。
 

圖3. 靶區(qū)域選擇示意圖

（a）基因A與基因B共有一個外顯子（標(biāo)藍(lán)的外顯子），因此選擇靶區(qū)域時應(yīng)遵循不影響其他基因的原則，不以共有的外顯子作為靶區(qū)域。（b）存在多個轉(zhuǎn)錄本時，為了能敲除所有的轉(zhuǎn)錄本，應(yīng)選擇在多個轉(zhuǎn)錄本均存在，且在編碼區(qū)的前50%的外顯子（此處選擇標(biāo)紅的外顯子）作為靶區(qū)域。（c）片段敲除時，因基因片段過大不能全部敲除而選擇敲除部分外顯子，敲除片段的編碼序列之和應(yīng)為非3的倍數(shù)，使后面的蛋白發(fā)生移碼突變。

gRNA的設(shè)計
目前有較多提供gRNA設(shè)計的在線工具，常用的如張鋒實驗的CRISPOR（http://crispor.tefor.net/），只需輸入目標(biāo)序列，選定好種屬基因組與相應(yīng)的PAM，則可以得出多個gRNA，以及每個gRNA對應(yīng)的特異性、切割效率和潛在脫靶位點，一般選擇特異性、切割效率得分高的gRNA作后續(xù)實驗（圖4）。

如果需要手動設(shè)計gRNA，則需要考慮其特異性與切割效率。在靶點設(shè)計時要綜合考慮所有候選靶點的序列、位置、正負(fù)鏈、GC含量、潛在的脫靶位點等信息。
 

圖4. CRISPOR在線網(wǎng)頁設(shè)計sgRNA流程

脫靶分析
根據(jù)選擇的sgRNA，通過生物信息學(xué)方法，對sgRNA進(jìn)行脫靶分析。推薦使用CCTop（https://cctop.cos.uni-heidelberg.de:8043/）在線網(wǎng)頁進(jìn)行預(yù)測。將sgRNA序列輸入，選定相應(yīng)種屬基因組進(jìn)行分析（圖5）。并且對獲得的遺傳材料進(jìn)行檢測。挑選前10個潛在脫靶位點，通過PCR測序驗證是否脫靶。如果實驗要求較為嚴(yán)格的，則需要通過全基因組測序鑒定脫靶情況。
 

圖5. sgRNA在CCTop在線網(wǎng)頁的脫靶分析

sgRNA的設(shè)計，你學(xué)廢了嗎？不過這僅僅是基因編輯方案設(shè)計中的一環(huán)，基因編輯方案還需要考慮目的基因轉(zhuǎn)錄本分析、轉(zhuǎn)染方法、細(xì)胞克隆形成能力等多種因素，即使一位非常熟練的方案設(shè)計專家出一份方案都需要幾個小時或更長，且疏漏也在所難免。