由機械力觸發(fā)的正畸牙齒移動 (OTM) 取決于牙根周圍組織的重塑。長期以來，人們一直希望加速 OTM 過程，因為它有多種潛在的好處，包括縮短治療時間和減少副作用。牙周膜細胞 (PDLCs) 是牙周組織中主要的細胞成分之一，負責 OTM 期間的信號轉導。到目前為止，PDLCs 中機械應力誘導的遺傳變化和機械轉導機制仍未完全了解。

巨噬細胞起源于髓系前體，在 M-CSF 和 RANKL 的刺激下可分化為破骨細胞，從而在破骨細胞活性形成和骨吸收過程中發(fā)揮關鍵作用。巨噬細胞可以極化為 M1 和 M2 表型。最近的研究報道了 OTM 期間巨噬細胞M1/M2極化率升高，表明巨噬細胞極化對骨重塑的重要作用。然而，促使力誘導 M1 樣極化的因素尚未闡明，這促使我們探索更多力誘導的遺傳變化，這會導致巨噬細胞和 PDLCs 在機械轉導過程中的功能改變。

生長分化因子15 (GDF15) 是人類轉化生長因子β (TGF-β) 超家族的成員之一。與其他家族成員一樣，它參與許多信號通路的調控，包括 ERK 和 SMADs 。至于 GDF15 在破骨細胞分化中的作用，已證明缺氧能夠誘導 GDF15 表達，促進 NF-κB 活化，從而促進破骨細胞生成。在腫瘤進展中也報道了其對破骨細胞分化的促進作用。

盡管 GDF15 在破骨細胞生成中起關鍵作用，但很少有研究報道它對機械刺激，特別是壓力刺激和隨后的生物學事件的反應。基于此，由北京大學口腔醫(yī)學院、口腔數字醫(yī)學北京市重點實驗室、口腔數字化醫(yī)療技術和材料國家工程實驗室的專家學者進行了合作研究，旨在探索 GDF15 在人PDLCs中對壓力的響應及其對破骨細胞分化和巨噬細胞M1/M2極化的影響，并進一步剖析了 GDF15 促進破骨細胞生成的可能分子機制，以及施加力后導致GDF15上調的上游調控因子。

實驗結果：

壓力誘導人 PDLCs 中 GDF15 的激活

為了剖析 GDF15 在 PDLCs 機械轉導中的作用，首先評估了 GDF15 對壓力的響應。為此，將 PDLCs置于0 ~ 1.5 g/cm2的連續(xù)壓力下持續(xù)24 h，然后進行western blot和RT-qPCR檢測GDF15的表達變化。

結果表明，在壓力刺激下，GDF15 在蛋白質和 mRNA 水平上均顯著增加（圖1 A、B）。為了進一步鞏固這一點，將 PDLCs 在1.5 g/cm2的壓力下持續(xù)0 - 24小時。RT-qPCR 的結果也一致證明了 GDF15 表達的上調（圖1 C ）。

因此，這些數據表明 GDF15 在人 PDLCs 中被壓力轉錄上調。

圖  1
 

GDF15促進RAW264.7細胞破骨細胞的分化

接下來，實驗試圖研究GDF15在力刺激下的功能作用，假設 PDLCs 分泌的 GDF15 可能有助于單核細胞的破骨細胞分化。為了測試這一點，在存在或不存在重組 GDF15 蛋白 (rGDF15) 的情況下，在 RANKL 誘導的 RAW264.7 細胞中進行了 TRAP 染色。數據表明，GDF15正調控破骨細胞的分化。

為了探索 GDF15 是否在力誘導的破骨細胞分化中發(fā)揮作用，收集GDF15敲低或對照細胞壓力處理后的PDLCs上清液，然后將 RAW264.7 細胞與這些上清液共培養(yǎng)。RT-qPCR 的結果顯示，CK 和 TRAP 的表達在 GDF15 敲低的細胞中均顯著下調，表明 GDF15 在由壓力觸發(fā)的破骨細胞分化中起重要作用。

GDF15 對于力誘導的促炎細胞因子和 RANKL/OPG 比率的上調起重要作用

在確定了 GDF15 對破骨細胞分化的促進作用后，研究人員開始解開其潛在的分子機制。PDLCs 在壓力下會產生一系列促炎細胞因子，這些細胞因子有助于破骨細胞前體細胞的募集和破骨細胞的成熟。為了檢查 GDF15 在此過程中的作用，使用 rGDF15 處理 PDLCs。隨后的 RT-qPCR 分析表明，IL-6、IL-8 和 COX2 的表達在添加 GDF15 的 PDLCs 中增強。相反，當 GDF15 的表達被 siRNA 敲低時，這些炎癥因子的力誘導上調明顯受損。

在炎癥因子中，RANKL 表達可以觸發(fā)下游信號通路，而 OPG 是破骨細胞生成的負調控因子。RANKL/OPG 在 OTM 期間被上調并發(fā)揮關鍵作用。使用 rGDF15 處理 PDLCs，發(fā)現RANKL/OPG比值上調。相比之下，當 GDF15 表達被 siRNA 轉染敲低時，壓力誘導的 RANKL/OPG 上調明顯減弱。

總的來說，這些數據表明GDF15在壓力誘導的炎癥因子充分激活和RANKL/OPG中具有不可或缺的作用。

GDF15 促進 M1 樣巨噬細胞極化

最近的研究報道稱，壓力可以誘導巨噬細胞向 M1 方向極化，這在 OTM 的破骨細胞分化中起重要作用。因此，實驗研究了GDF15 是否參與巨噬細胞極化的調控。

為了闡明這一點，用 rGDF15 處理 RAW264.7 細胞。RT-qPCR結果顯示，加入GDF15后M1標記基因IL-1β和IL-6表達增強，而M2標記基因Dectin表達降低，表明GDF15促進了RAW264.7中M1樣巨噬細胞的極化。

GDF15 有助于在壓力下激活 NF-κB 和 ERK 通路

接下來，開始探索 GDF15 促進促炎細胞因子表達的潛在機制。首先關注 NF-κB，它在細胞對機械刺激和破骨細胞分化的反應中發(fā)揮核心作用。GDF15 可能有助于 PDLCs 中 NF-κB 的激活，從而促進下游促炎基因的轉錄。為了驗證這一點，在施加壓力之前，在 PDLCs 中敲低GDF15，Western blot檢測NF-κB在細胞核和細胞質中的分布變化。

圖2 A的結果顯示，壓力誘導NF-κB進入核。然而，當 GDF15 表達被抑制時，力誘導的 NF-κB 進入核的能力減弱，表現為細胞質中 NF-κB 增加，細胞核中NF-κB 減少。

巨噬細胞中的 NF-κB 活化對于破骨細胞分化很重要，因此檢測了 GDF15 對 RAW264.7 細胞中 NF-κB 的影響。正如預期的那樣，細胞核中 NF-κB 在 GDF15 處理的細胞中更豐富，而細胞質中 NF-κB 則相反（圖2 B）。

這些結果表明 GDF15 有助于力誘導的 NF-κB 激活。

除了 NF-κB，MAPK/ERK 是破骨細胞分化的另一個重要途徑。實驗假設 GDF15 也有助于力誘導的 ERK 激活。為了證明這一點，將 RAW264.7 細胞與用GDF15處理和壓力處理后的PDLCs上清液共培養(yǎng)。Western blot分析顯示，GDF15耗盡后，力誘導的ERK磷酸化水平降低 (圖2 C)。此外，GDF15 的施用還增強了ERK兩個經典下游靶基因C-FOS和CCND1的表達 (圖2 C、D)。

這些數據共同驗證了 GDF15 在調控 NF-κB 和 ERK 通路以響應壓力中的作用。

圖  2

GDF15 在 PDLCs 中受 YAP 調控

闡明了 GDF15 調控的信號通路后，研究人員試圖描繪出負責力誘導的GDF15上調的上游信號分子。

YAP/TAZ 作為 Hippo 信號的重要節(jié)點，在機械轉導過程中起著舉足輕重的作用。由于YAP在乳腺癌細胞中抑制GDF15的表達，推測PDLCs中GDF15也可能受到YAP的負調控。用 YAP 抑制劑 Verteporfin 處理 PDLCs，發(fā)現 YAP 抑制后 GDF15 的蛋白質水平顯著增加，這證實了 YAP 對 GDF15 的負調控作用。

此外，使用MST1/2 抑制劑 XMU-MP-1處理后，抑制了GDF15 的表達。由于 MST1/2 是內源性 MOB1、LATS1/2 和 YAP 磷酸化的激酶，它的抑制會導致 YAP 的激活。因此，這間接證明了 YAP 激活可以抑制 GDF15 的表達。

實驗結論：

總之，該研究結果突出了GDF15是壓力誘導破骨細胞分化的重要介質，從而為 OTM 期間 PDLCs 介導的破骨細胞生成的分子機制提供了新的見解。

參考文獻：Li S, Li Q, Zhu Y, Hu W. GDF15 induced by compressive force contributes to osteoclast differentiation in human periodontal ligament cells. Exp Cell Res. 2020 Feb 1;387(1):111745. doi: 10.1016/j.yexcr.2019.111745. Epub 2019 Nov 22. PMID: 31765611.
 

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