上期我們已經(jīng)學習了細胞基本形態(tài)，細胞健康及異常狀態(tài)下的特征，學會如何辨別細胞是否異常，接著從污染方面進行了深度解析。

但是導致細胞形態(tài)異常的罪魁禍首并不一定是污染，今天我們將從細胞培養(yǎng)營養(yǎng)體系、傳代操作、培養(yǎng)條件、耗材等方面進行深度的剖析。
 

營養(yǎng)體系

細胞對于營養(yǎng)體系是有需求差異的
 

l 細胞名稱并不能判斷細胞是否好養(yǎng)

癌細胞只是“長生不老”，不代表它需要的營養(yǎng)可以降低，原代壽命短暫（分裂50-60次），但也不代表它對營養(yǎng)的需求高。

l 營養(yǎng)體系

絕大多數(shù)細胞均可使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基+血清來養(yǎng)，少數(shù)細胞可以使用無血清體系培養(yǎng)，并且未來細胞培養(yǎng)體系的走勢是趨向于無血清培養(yǎng)體系發(fā)展的。

l 細胞合適的營養(yǎng)體系

下面是較權(quán)威的細胞培養(yǎng)體系查詢網(wǎng)站，可供大家參考。

ATCC：https://www.atcc.org/

中國菌種庫：http://www.biobw.org/

 

血清

因為細胞所需的營養(yǎng)因子來自于血清，因此血清的這些事兒大家也需要了解~

01 血清主要成分介紹

成分	濃度		成分	濃度
蛋白和多肽			磷脂	0.7-3.0 mg/ml
白蛋白		20-50 mg/ml	丙酮酸	2-10 μg/ml
胎球蛋白		10-20 mg/ml	碳水化合物
纖連蛋白		1-10 ug/ml	葡萄糖	0.6-1.2 mg/ml
球蛋白		1-15 mg/ml	乳酸	0.5-2.0 mg/ml
α-抗胰蛋白酶		0.5-2.5 mg/ml	多胺
轉(zhuǎn)鐵蛋白		2-4 mg/ml	丁二胺,亞精胺	0.1-1.0 uM
生長因子			尿素	170-300 ug/ml
EGF, PDGF, IGF-I, IL-1		1-100 ng/ml	無機物
氨基酸       0.01-1.0 uM			鈣，氯化物，鉀，磷
脂質(zhì)			激素
膽固醇		10 uM	胰島素	1-100 ng/ml
脂肪酸		0.1-1.0 uM	皮質(zhì)醇	10-200 nM
亞油酸		0.01-0.1 uM	維生素           10 ng-10 ug/ml

02 血清批間差
血清來源于動物，其組成成分有1000多種，且血清組成及含量常隨供血動物的年齡、生理條件和營養(yǎng)條件而變化。因此，每個批次的組分百分比含量都是不固定的，批間差異是不可避免的。

1）血清批間差可導致細胞聚團

 

小鼠黑色素瘤細胞B16-F10（圖源客戶，僅供學習參考）

 

2）血清批間差可導致細胞形態(tài)改變，導致細胞失去原本該有的上皮樣，成纖維樣或神經(jīng)母瘤樣形態(tài)，邊緣模糊潰爛或長角。

293T人腎上皮細胞系（圖源客戶，僅供學習參考）

3）血清批間差可導致胞內(nèi)空泡化

03 細胞對于血清批間差敏感有以下表現(xiàn)：

l     新開了一瓶血清（貨號沒變，批號改變），復蘇或傳代后的細胞形態(tài)正常，增殖變慢，本來2天傳的，可能要3或4天傳了，可以適當加高血清比例到15%或20%（最高不能超過20%）。

l     新開了一瓶血清（貨號沒變，批號改變），復蘇或傳代后的細胞前2代還可以，然后越傳越差，形態(tài)改變，增值緩慢，一般傳到5，6代，細胞無法再繼續(xù)傳代。

l     新開了一瓶血清（貨號沒變，批號改變），復蘇或傳代后的細胞半死不活的樣子，不增殖也不凋亡。

l     新開了一瓶血清（貨號沒變，批號改變），復蘇或傳代后的細胞漂浮嚴重，貼壁性變差，凋亡嚴重。

 

04 血清批間差預防及處理辦法
預防

建議先進行批號測試，篩選出合適批號，購買半年甚至一年以上的用量，避免批間差造成實驗波動（胎牛血清在-20℃保存可達5年）。

處理

1 ) 建議加高血清比例到15%~20%

2 ) 可購買ITS（4%胎牛血清+1%ITS+95%基礎(chǔ)培養(yǎng)基）

3 ) 更換血清批次

基礎(chǔ)培養(yǎng)基

01基礎(chǔ)培養(yǎng)基的成分

成分		濃度
氨基酸
必需氨基酸	苯丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、色氨酸、蘇氨酸和蛋氨酸（8種）	16-146 mg/L
非必須氨基酸	丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、脯氨酸、絲氨酸和酪氨酸（12種）	30-584 mg/L
無機鹽
二水氯化鈣、Ferric nitrate、硫酸鎂無水、KCl、氯化鈉、無水磷酸二氫鈉、碳酸氫鈉		0.1-6400 mg/L
維生素
氯化膽堿、泛酸鈣、葉酸、煙酰胺、鹽酸吡哆醛、核黃素、鹽酸硫胺素、肌醇		0.4 -7.2 mg/L
碳水化合物
葡萄糖		1000-4500 mg/L
丙酮酸鈉		110 mg/L
其它
酚紅		15.9 mg/L

02 培養(yǎng)基的選擇性表現(xiàn)

l     有的細胞用不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基增殖效果和形態(tài)很好，沒有明顯差別。

l     有的細胞使用不同的培養(yǎng)基增殖效果都可以，但存在一種增殖速度與形態(tài)是最優(yōu)的產(chǎn)品。

l     有的細胞可能只適合特定的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，細胞對于培養(yǎng)基的某種條件要求比較高（比如pH緩沖性，滲透壓，微生物或葡萄糖的需求等）。

03 細胞對于基礎(chǔ)培養(yǎng)基敏感表現(xiàn)

l      基礎(chǔ)培養(yǎng)基為化學合成定量生產(chǎn)產(chǎn)品，批間差幾乎不存在。

l      在未更換血清品牌及批次的前提下更換了基礎(chǔ)培養(yǎng)基，可能導致細胞復蘇或傳代后增殖變慢，不同品牌同種培養(yǎng)基的濃度含量也是有差異的。

l      在未更換血清品牌及批次的前提下，培養(yǎng)基開封4℃下放置超過一個月，在這一個月內(nèi)細胞增殖速度越來越慢，有可能是谷氨酰胺降解或二氧化碳溢出導致pH值降低，培養(yǎng)基偏紫，因此，建議培養(yǎng)基開封后一周內(nèi)使用完。

04 特殊細胞對于生長因子的需求

生長因子	作用
成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)	促進成纖維細胞、平滑肌細胞增殖
表皮細胞生長因子（epidermal growth factor，EGF)	促進上皮細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞的增殖
血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）	促進血管內(nèi)皮細胞增殖
白介素（Interleukin 2，IL-2）	促進T淋巴、B淋巴、NK細胞、LAK、TIL細胞增殖
重組胰島素（Insulin, BI:01-818）	胰島素能刺激眾多的細胞增殖與分化
牛垂體提取液（BPE)	BPE是無血清的促有絲分裂添加劑,含有天然生長因子的獨特混合物,可促進上皮、干細胞等增殖
氫化可的松（hydrocortisone）	促進特定細胞增殖如人正常乳腺上皮細胞
霍亂霉素（choleratoxin）	促進特定細胞增殖如人正常乳腺上皮細胞
牛血清白蛋白（BSA)	主要用于無血清培養(yǎng)基中，白蛋白可起到生理和機械保護作用和載體作用
B27	神經(jīng)細胞培養(yǎng)無血清添加劑，適用于大鼠海馬和皮質(zhì)神經(jīng)元的長期培養(yǎng)

傳代操作

傳代過程中胰酶消化過程會影響細胞，導致出現(xiàn)聚團現(xiàn)象。

小鼠黑色素瘤細胞B16-F10（（圖源客戶，僅供學習參考）

 

復蘇的原代細胞增殖良好，一旦傳代就出現(xiàn)聚團，除圖例中的，還有間充質(zhì)干細胞尤其“喜歡”聚團現(xiàn)象。

這時需要考慮一下幾點：

1、胰酶純度

普通胰酶（0.25%胰蛋白酶，0.02%EDTA)純度不夠高，含有的雜酶，比如羧肽酶對細胞有傷害，像神經(jīng)元類會比較敏感，比如小鼠海馬神經(jīng)元HT22。

2、胰酶消化不足或過度

消化不足，細胞粘連在一起，吹打時細胞成片脫落，容易聚團；

消化過度，細胞消化嚴重，破損的細胞碎片容易粘連聚團。

3、操作不當

吹打過猛，細胞機械損傷大，細胞聚團明顯。

培養(yǎng)條件

溫度

哺乳動物是37℃，昆蟲細胞是28℃。

濕度

通過向水盤加水，讓水分蒸發(fā)，濕度達到95%。

二氧化碳

CO₂既是細胞代謝產(chǎn)物，也是細胞所需成分，它主要與維持培養(yǎng)液的pH有直接關(guān)系。

耗材

培養(yǎng)瓶的改性處理

培養(yǎng)瓶的主要成分是 polystyrene（PS），其表面是疏水的，一次性細胞培養(yǎng)皿等標明Tissue culture treated，是表明該器皿經(jīng)過表面的改性處理，適合貼壁細胞的培養(yǎng)。

細胞不貼壁

不止一位用戶培養(yǎng)細胞，細胞呈現(xiàn)成片增殖，密度不均勻，空白地方“寸草不生”，這個時候極有可能是耗材改性處理不當或不均勻所致。
 

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