本應用說明討論了對于細胞粘附到 ibidi µ-Patterns 的重要實驗參數。此外，它還解釋了如何優(yōu)化細胞粘附和模式覆蓋。

關鍵詞

· µ-Patterning、粘附、結合基序、單細胞模式、多細胞微模式、細胞培養(yǎng)、粘附細胞

細胞類型

ibidi µ-Patterning 的成功實驗僅限于貼壁細胞類型——懸浮細胞不能附著在圖案表面。此外，對 µ-Pattern 表面的粘附高度依賴于細胞類型，因為并非所有細胞類型都與所有結合基序結合。因此，在開始實驗之前，有必要測試所選細胞類型是否能夠粘附在圖案表面上。

 

結合基序

ibidi µ-Patterning 技術為細胞粘附提供共價結合的結合基序。這些結合基序的表面密度可能不同于經典的蛋白質涂層。因此，結合基序可能導致細胞形態(tài)或粘附行為的改變。測試您的細胞是否與結合基序兼容的最佳方法是將它們接種在具有大粘合面積的圖案點上（例如，多細胞圖案）。驗證單元格兼容性后，您可以切換到更小的模式，例如單單元格模式。

 

幾何圖案

由于結合基序的數量，圖案幾何形狀會影響細胞的粘附行為。例如，較小的形狀呈現較少的結合基序，與較大的形狀相比，這可能會降低細胞粘附。特別是對于單細胞實驗，需要在圖案上實現單細胞占有率，圖案尺寸非常重要，因為太小的圖案阻礙了適當的細胞粘附和擴散，而太大的圖案會導致多個細胞粘附在一個單點。此外，當所用細胞類型的間距太小時，粘附斑塊之間的間距會影響理想的細胞接種濃度和細胞從一個點到另一個點的橋接。

細胞接種濃度

接種濃度是優(yōu)化粘附過程的另一個關鍵參數。較低的濃度會導致圖案上的細胞較少，或者只有稀疏占據的斑點，但結塊較少。較高的細胞濃度可以提高細胞覆蓋率，但要承擔 a) 結塊和 b) 在單細胞粘附位點上出現多個細胞的風險。如果細胞濃度太高并且細胞在附著到粘附點之前開始聚集，這些漂浮的聚集體可能會從模式中分離粘附細胞并阻止進一步的細胞粘附。

 

細胞懸液質量

細胞懸液的均勻性高度影響實驗輸出。沒有任何細胞聚集體的單細胞懸浮液非常適合單細胞檢測。接種細胞簇或球體懸浮液是 3D多細胞檢測的一種選擇。

 

培養(yǎng)時間

接種細胞后的孵育時間會影響粘附過程。與其他表面相比，細胞附著在圖案上所需的時間可能不同。在粘合過程中移動 µ-Patterned 載玻片時要特別小心。未連接或僅松散連接的細胞可能會開始結塊。

 

機械應力和洗滌

部分附著的細胞可能會被機械力沖走。利用這種效果有助于去除細胞或碎片。根據洗滌步驟的強度（剪切應力），可能會從表面洗掉更多或更少的細胞。

 

細胞適合度

細胞的活力和適應性是適當細胞粘附的重要因素。因此，請確保優(yōu)化細胞制備過程，以最大限度地減少細胞壓力。優(yōu)化和標準化影響細胞健康的因素，例如化學分離、溫度、機械應力、懸浮時間、培養(yǎng)基成分和其他細胞培養(yǎng)參數。

優(yōu)化 µ-Pattern 上的細胞粘附

 

 

初步測試：細胞類型是否與 µ-Pattern 兼容？

 

如果您不知道您的細胞類型是否與 µ-Patterning 的結合基序兼容，我們建議首先在多細胞 µ-Pattern 上運行初始細胞粘附測試。在較大圖案上測試粘附減少了對結合基序本身的初始兼容性測試，同時排除了單細胞和圖案幾何效應。

· 按照說明中的協議使用 2-3 種不同的細胞接種濃度，并通過將它們孵育至少 4 小時直至過夜，讓細胞不受干擾地粘附。

· 在洗掉未附著的細胞之前, 用相差顯微鏡控制細胞附著。拍攝細胞圖像總是有助于隨后優(yōu)化過程。

· 洗滌后至少 2 小時拍攝額外的圖像，讓細胞有時間從洗滌時經歷的剪切應力中恢復。

請注意：在此階段，不需要最佳模式覆蓋。任何細胞都堅持該模式是很重要的。如果是這種情況，您可以繼續(xù)優(yōu)化所需模式的播種參數。如果您在孵育過夜后仍未在圖案上看到任何細胞附著，則您的細胞類型可能與所使用的結合基序不兼容。

優(yōu)化附著在 µ-Pattern 上的細胞的播種參數

 

如果您知道細胞與 µ-Pattern 的結合基序結合，則可以開始優(yōu)化所需模式上的細胞接種參數。請考慮每個模式都需要針對您的特定細胞類型進行優(yōu)化，因為模式大小和模式之間的距離在很大程度上影響播種參數。確保細胞至關重要，并且您有單細胞懸液。

 

第一次優(yōu)化運行

· 按照說明在載玻片上接種至少三種不同濃度的細胞。

· 讓細胞在洗滌前無干擾地粘附至少 4 小時。

· 在洗滌前和洗滌后至少 2 小時拍攝細胞圖像。

 

可能的結果和故障排除

 

– 洗滌后，細胞很好地固定在圖案上，圖案覆蓋度很好。

您已經為您的實驗找到了合適的播種參數。您可以使用相同的條件開始您的實驗。

 

– 洗滌前，只有少數細胞漂浮和聚集。洗滌后，圖案上的細胞很少，圖案覆蓋率差。

細胞密度可能太低。在洗去未附著的細胞之前，嘗試更高的接種濃度并考慮更長的孵育時間。

 

– 在洗滌之前，有很多漂浮的、聚集的細胞。洗滌后，圖案上的細胞很少，圖案覆蓋率差。

細胞密度可能太高。嘗試降低初始接種濃度，因為過高的細胞密度通常會導致細胞聚集，阻礙細胞與模式結合。此外，在播種后 2 小時和 3 小時檢查細胞，看看更短的孵化時間是否會導致更少的聚集，從而更好地覆蓋模式。

 

– 洗滌后，圖案上會出現不需要的細胞聚集。

這表明初始接種濃度太高/或洗滌前孵育時間太長。嘗試較低的接種濃度，并在 2 小時和 3 小時后檢查細胞，看看較短的孵育時間是否足以使細胞粘附良好。

 

– 當使用小的單細胞斑點或細線時，圖案上沒有細胞粘附或細胞呈圓形且不會擴散。

如果您從之前的實驗中知道細胞可以與所使用的圖案結合基序結合，則圖案尺寸對于您的細胞類型來說可能太小，并且細胞沒有足夠的空間來正確傳播和粘附。因此，為您的實驗使用更大的圖案尺寸。

 

第二次優(yōu)化運行

· 如上所述，根據第一次優(yōu)化運行的結果使用優(yōu)化的細胞培養(yǎng)參數。

將您的結果與第一次優(yōu)化運行進行比較，如有必要，進入另一輪優(yōu)化。

示例圖像

圖1，L929 細胞不同接種濃度對單個細胞模式的影響。(A) 將細胞以 1*10 5cells/ml加入µ-Slide VI 0.4，(B) 3*10 5 cells/ml、(C) ) 5.25*105 cells/ml。24 小時后，洗去未附著的細胞，并在洗滌后 2 小時拍攝圖像。在低接種密度下，許多點沒有被任何細胞覆蓋。然而，在太高的接種濃度下，細胞開始在圖案上聚集。

 

 

圖 2：不同圖案孔大小對 Rat1 細胞在單個細胞圖案上的傳播行為的影響。將細胞接種到 µ-Slide VI0.4中，µ-Pattern 為 (A) 20 µm 正方形，距離為 110 µm 或 (B) 30 µm 正方形，距離為 110 µm，濃度為 9*105 cells/ml。24 小時后，洗去未附著的細胞，并在洗滌后 2 小時拍攝圖像。對于 Rat1 細胞，20 µm 正方形對于良好的細胞擴散來說太小了，而 30 µm 正方形為細胞提供了足夠的區(qū)域以在圖案上展平。

 

圖 3：不同圖案幾何形狀對 NIH3T3 細胞在單個細胞圖案上的擴散行為的影響。將細胞接種到 µ-Slide VI0.4中，µ-Pattern 為 (A) 20 µm 正方形，距離為 110 µm，或 (B) 30 µm 正方形，距離為 110 µm，濃度為 3* 10 5 cells/ml。24 小時后，洗去未附著的細胞，并在洗滌后 2 小時拍攝圖像。對于 NIH3T3 細胞，20 µm 正方形對于良好的細胞擴散來說太小了，而 30 µm 正方形為細胞提供了足夠的區(qū)域以使其在圖案上變平。然而，由于圖案邊緣之間的距離小了 10 µm，細胞能夠從一個點連接到另一個點。對于該細胞系，需要更大的圖案之間的距離。

 

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