隨著針對(duì)PI3K通路的新療法的批準(zhǔn)，PIK3CA突變的檢測(cè)已成為HR+/HER2- 轉(zhuǎn)移性乳腺癌 (MBC) 治療管理的關(guān)鍵因素。法國(guó)雷恩第一大學(xué)尤金馬奎斯癌癥中心在《Scientific Reports》上發(fā)表了一篇文章，該文章采用naica®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)開(kāi)發(fā)了多重PIK3CA突變檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)可同時(shí)檢測(cè)21種PIK3CA突變，并進(jìn)行絕對(duì)定量，解決了當(dāng)前對(duì)乳腺癌患者的21種PIK3CA致病突變進(jìn)行快速、高靈敏、有效檢測(cè)的難題。

亮點(diǎn)

1.在naica®微滴芯片數(shù)字PCR平臺(tái)，使用液體活檢技術(shù)對(duì)21種PIK3CA突變進(jìn)行定量檢測(cè)。

2. 通過(guò)對(duì)大量的腫瘤實(shí)體樣本和cfDNA樣本進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證，獲得了83.1%的一致性，確定了此方案的臨床有效性。

3.naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)檢測(cè)方法的高靈敏度和穩(wěn)定性，能夠快速、經(jīng)濟(jì)、有效地對(duì)乳腺癌中最常見(jiàn)的PIK3CA致病突變進(jìn)行絕對(duì)定量，覆蓋率達(dá)90%。

檢測(cè)方式

利用naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)(Stilla Technologies)，結(jié)合Drop-off檢測(cè)方法，設(shè)計(jì)了一種可以同時(shí)檢測(cè)21個(gè)PIK3CA突變的方法。在陽(yáng)性分析案例中可精確識(shí)別PIK3CA突變。通過(guò)分析來(lái)自213個(gè) HR+/HER2- MBC樣本的血漿循環(huán)游離DNA (cfDNA) 以及從89名患者的97個(gè)可用匹配腫瘤中提取的DNA，確定了此方案的臨床有效性，并在cfDNA分析和相應(yīng)腫瘤樣本分析之間獲得了83.1% 的一致性。

該技術(shù)采用兩種Assay配合三步診斷策略（圖1，圖2），首先進(jìn)行PIK3CA突變初步篩選，如果沒(méi)有PIK3CA突變，則認(rèn)為標(biāo)本為陰性。在陽(yáng)性結(jié)果的情況下，進(jìn)行第二步檢測(cè)集中于四種最常見(jiàn)的PIK3CA突變，并進(jìn)行WT-MUT Duplex聯(lián)合分析確定陽(yáng)性突變位點(diǎn)。

圖1左：PIK3CA突變檢測(cè)的兩種多重檢測(cè)方法設(shè)計(jì)圖。(a) PIK3CA Assay n°1設(shè)計(jì)圖:使用四對(duì)引物(灰色箭頭)同時(shí)擴(kuò)增N345K、C420R、 H1047L和H1047R。使用Drop-off方法檢測(cè)542-546突變。(b) Drop-Off 542-546檢測(cè)原理: WT序列由HEX標(biāo)記的Drop-off探針和cy5標(biāo)記的reference探針檢測(cè)，產(chǎn)生一簇HEX-Cy5雙陽(yáng)性微滴(2D點(diǎn)圖上為黃色簇);而542 - 546密碼子上帶有突變(MUT，紅色叉)的序列則無(wú)法與Drop-off探針結(jié)合，只和reference探針結(jié)合，生成單陽(yáng)性微滴(2D點(diǎn)圖上的紅色簇) (c) PIK3CA Assay n°2設(shè)計(jì)圖:使用兩對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增兩個(gè)序列，使用FAM探針標(biāo)記野生型(WT)序列，使用HEX探針標(biāo)記E542K和E545K突變，使用FAM和Cy5探針標(biāo)記H1047L突變，使用Cy5探針標(biāo)記H1047R突變；圖一右：三步診斷策略。

圖2：使用PIK3CA檢測(cè)在患者cfDNA樣本上鑒定PIK3CA突變示例。(a)四種最常見(jiàn)的PIK3CA 突變（E542K、E545K、H1047L和H1047R）的2D圖結(jié)果，首先使用PIK3CA Assay n°1檢測(cè)，各自的MAF為16.86%、4.17%、17.13%和1.97%。并使用PIK3CA Assay n°2確認(rèn)，各自的MAF分別為17.40%、5.25%、19.55%和1.97%。(b)其他突變（N345K、C420R、Q546K、Q546P和Q546R）的2D圖結(jié)果，首先使用PIK3CA Assay n°1檢測(cè)，各自的MAF為4.00%、3.83%、35.02%、1.16%和39.2%，并使用WT-MUT Duplex方法確認(rèn)，各自的MAF分別為6.99%、6.50%、36.84%、0.71%和43.89%。

結(jié)果分析

結(jié)果顯示，213份血漿中68名患者(32%)至少有一種突變，這與文獻(xiàn)中普遍報(bào)道的結(jié)果一致。有6例患者每個(gè)樣本有2個(gè)突變，共發(fā)現(xiàn)74個(gè)突變。在本文的檢測(cè)方法可能檢測(cè)到的21個(gè)突變中，有9個(gè)在血漿樣本中檢測(cè)到（圖3a、b）。此外,本方法檢測(cè)的相對(duì)頻率與COSMIC數(shù)據(jù)庫(kù)中列出的頻率相當(dāng)一致，該方法能夠快速、經(jīng)濟(jì)、有效地對(duì)乳腺癌中最常見(jiàn)的PIK3CA致病突變進(jìn)行絕對(duì)定量，覆蓋率達(dá)90%

圖3：213例HR + /HER2−轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者血漿中PIK3CA突變檢測(cè)(a)在213例HR + /HER2−轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中，PIK3CA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)9個(gè)PIK3CA突變陽(yáng)性病例數(shù)。(b)確定的9個(gè)PIK3CA突變的相對(duì)頻率。(c)突變?cè)谘獫{中濃度（copies/ml）和MAF(%)分布 (5例以上的突變用箱線圖表示，5例以下的突變用點(diǎn)表示，2例以上的突變用中位數(shù)線表示)。

原文：https://doi.org/10.1038/s41598-021-96644-6

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naica^®六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國(guó)Stilla Technologies公司naica^®六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)，源于Crystal微滴芯片式數(shù)字PCR技術(shù)，自動(dòng)化微滴生成和擴(kuò)增，每個(gè)樣本孔可實(shí)現(xiàn)6熒光通道的檢測(cè)，智能化識(shí)別微滴并進(jìn)行質(zhì)控，3小時(shí)內(nèi)即可獲得至少6個(gè)靶標(biāo)基因的絕對(duì)拷貝數(shù)濃度。