血球計數(shù)板
 

你知道嗎？血球計數(shù)板自18世紀(jì)首次被應(yīng)用于分析人的血液樣本以來，逐漸發(fā)展為實驗室細(xì)胞計數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)工具。因為其操作簡單，對實驗環(huán)境要求不高，只要有一臺顯微鏡即可進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)操作。但如果想使用它得出較為精準(zhǔn)的結(jié)果則對操作者的要求很高，因為在操作時可能會帶來各種誤差：

1、計數(shù)操作引入誤差
血球計數(shù)板使用步驟較為復(fù)雜，計數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確度不僅和上樣后鋪滿計數(shù)池的均勻程度相關(guān)，同時濃度較高時的鏡下計數(shù)難度較大，不同操作者之間的計數(shù)差異甚至高達(dá)52%，即使同一個人的操作差異仍有可能達(dá)20%^[1]。所以需要在實際計數(shù)過程中，同一操作者在相同的條件下進(jìn)行多次計數(shù)以減小誤差^[2]。

2、計算過程引入誤差
通過血球計數(shù)板獲取的數(shù)據(jù)結(jié)果，需要在鏡下一邊計數(shù)一邊記錄，再對結(jié)果通過一系列的計算，從而轉(zhuǎn)化成實際的細(xì)胞濃度數(shù)據(jù)，然后計入細(xì)胞原液的稀釋倍數(shù)（如臺盼藍(lán)的稀釋等），即可得到目的細(xì)胞樣品的濃度。計算過程中的誤差也會影響到最終的實驗結(jié)果^[3]。

3、樣品制備引入誤差
首先，均勻細(xì)胞懸液樣本的準(zhǔn)備對計數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。對于某些極易聚團(tuán)或未能均勻打散的細(xì)胞懸液，人工計數(shù)時，往往不易識別導(dǎo)致誤差被放大。其次，依據(jù)大多數(shù)實驗室的習(xí)慣，通常會采取對四個頂角的大格內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計計數(shù)，每個大格的細(xì)胞量一般在30-50個之間時，計數(shù)結(jié)果會更加準(zhǔn)確。這就意味著，細(xì)胞懸液濃度過高或過低都不利于獲得準(zhǔn)確的結(jié)果。多數(shù)情況下，我們需要對懸液進(jìn)行有效的稀釋。

另外，不僅操作因素會導(dǎo)致誤差出現(xiàn)，本身血球計數(shù)板的設(shè)計對標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程也有一定考究。

據(jù)一項研究表明，在計數(shù)過程中，蓋玻片的位置偏移可造成7.6%的計數(shù)差異^[4]，不同品牌的蓋玻片質(zhì)量厚度對樣品的均勻擴(kuò)散也會有一定影響。同時血球計數(shù)板計數(shù)的視野面積也影響著計數(shù)的準(zhǔn)確度，常用計數(shù)板進(jìn)行普通細(xì)胞系計數(shù)時的計數(shù)面積為1mm2，取樣面積越小，CV值越高、誤差越大^[5]。并且，若血球計數(shù)板清潔過度、清洗不到位或操作不當(dāng)導(dǎo)致計數(shù)室存在劃痕會對操作和結(jié)果都造成很大影響，被清洗掉的細(xì)胞樣本若不妥善處理也會將操作者暴露在生物安全危險下。

計數(shù)板的計數(shù)面積

很多研究者已經(jīng)逐漸使用機(jī)器的自動計數(shù)來代替手動計數(shù)，相對來講各方面因素更好控制，得出的結(jié)果可靠性更高，目前細(xì)胞計數(shù)的金標(biāo)準(zhǔn)仍為最為可靠的流式細(xì)胞術(shù)檢測，但是其高昂的儀器價格和維護(hù)成本導(dǎo)致其普及程度和覆蓋情況還不是很廣，所以自動細(xì)胞計數(shù)儀是目前性價比更高的解決方案。為什么自動細(xì)胞計數(shù)儀是自動計數(shù)最佳方案？

首先，機(jī)器計數(shù)可減少人工計數(shù)過程中造成的誤差，通過軟件算法直接獲得數(shù)據(jù)結(jié)果，其中圖像式的計數(shù)儀還能生成清晰的樣本圖像進(jìn)行保存，方便后續(xù)數(shù)據(jù)處理。

第二，機(jī)器自動計數(shù)后會根據(jù)相應(yīng)的公式運算規(guī)則直接得出結(jié)果，并且還會內(nèi)置輔助計算軟件，將人為計算造成的誤差降到最小。

第三，相對來說機(jī)器計數(shù)對樣品制備的要求沒那么高，由于技術(shù)和算法的區(qū)別，比手動計數(shù)能識別的濃度準(zhǔn)確區(qū)間更大，樣本的預(yù)稀釋操作在一定程度上被簡化，同時對難離散的細(xì)胞懸液中的聚團(tuán)細(xì)胞進(jìn)行分別識別并獨立計數(shù)，提高對分布不均勻樣品計數(shù)的準(zhǔn)確度。
 

圖像式計數(shù)儀采集面積3.5mm2 VS 手動計數(shù)1mm2

并且，機(jī)器計數(shù)一般使用相應(yīng)的一次性耗材，不僅不需要蓋玻片等額外的耗材，減少上樣操作造成的樣品擴(kuò)散不均，繼而影響計數(shù)結(jié)果，同時一次性耗材無需清洗，保證重復(fù)性也避免了生物安全危害。另外圖像式的計數(shù)儀的采樣面積一般是人工計數(shù)的幾倍，采樣面積更大計入細(xì)胞更多、更準(zhǔn)確。還有很多計數(shù)儀有熒光功能，不僅能完成正常的計數(shù)操作，還可對不同的熒光標(biāo)記物進(jìn)行識別統(tǒng)計。

瑞沃德自動細(xì)胞計數(shù)儀可對懸液中的細(xì)胞快速進(jìn)行精準(zhǔn)定量分析，并同時顯示明場及熒光圖像，清晰呈現(xiàn)計數(shù)結(jié)果及細(xì)胞形態(tài)。計數(shù)面積更大，應(yīng)用方位更廣。適用于免疫學(xué)及疫苗開發(fā)、細(xì)胞治療、腫瘤研究、干細(xì)胞及代謝研究等研究領(lǐng)域的細(xì)胞分析。
 

[1] Freund M, Carol B. Factors Affecting Haemocytometer Counts of Sperm Concentration in Human Semen. Journal of Reproductive Fertility 1964; 8: 149-55.

[2] Davis JD. THE HEMOCYTOMETER AND ITS IMPACT ON PROGRESSIVE-ERA MEDICINE. Urbana: University of Illinois at Urbana-Champaign; 1995.

[3] Christensen P, Stryhn H, Hansen C. Discrepancies in the Determination of Sperm Concentration using Bürker-Türk, Thoma and Makler Counting Chambers. Theriogenology 2005; 63: 992-1003.

[4] Sanders C, Skerry DW. The Distribution of Blood Cells on Haemacytometer Counting Chambers with Special Reference to the Amended British Standards Specification 748 (1958). Journal of Clinical Pathology 1961; 14: 298-304.

[5]Ramsey JM. The Effects of Size of Sampling Area and Dilution on Leucocyte Counts in a Hemocytometer. The Ohio Journal of Science 1969; 69(2): 101-4.