介紹：

在全球范圍內(nèi)，癌癥每年造成約 1000 萬(wàn)人死亡。1與癌癥相關(guān)的死亡的主要原因不是原發(fā)腫瘤，而是癌癥轉(zhuǎn)移：惡性細(xì)胞侵入原發(fā)腫瘤以外的組織并在這些組織中擴(kuò)散1，基礎(chǔ)癌癥研究是世界衛(wèi)生組織降低癌癥死亡率1戰(zhàn)略的關(guān)鍵因素之一，研究轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制可為主要臨床問(wèn)題提供重要信息。

 

在癌癥轉(zhuǎn)移中，單細(xì)胞的遷移在很大程度上受化學(xué)線索的影響，化學(xué)線索通過(guò)趨化性2為細(xì)胞遷移提供方向：?jiǎn)渭?xì)胞沿著化學(xué)引誘物的濃度梯度遷移。3已經(jīng)描述了各種化學(xué)引誘物用于通常研究的細(xì)胞系。據(jù)報(bào)道，HeLa 細(xì)胞（宮頸癌細(xì)胞）向更高濃度的纖維連接蛋白4和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子 1α 遷移。5已描述大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系 C6 被緩激肽吸引。6包含所有上述化學(xué)引誘劑分子的細(xì)胞培養(yǎng)中常用的培養(yǎng)劑是胎牛血清 (FBS；未出生小牛的血清)。7-9因此，F(xiàn)BS 為化學(xué)線索提供了一個(gè)有趣且直接的模型系統(tǒng)提供給癌細(xì)胞。

 

然而，為了研究癌細(xì)胞對(duì)化學(xué)線索的反應(yīng)，需要在具有化學(xué)引誘劑梯度的環(huán)境中進(jìn)行準(zhǔn)確的細(xì)胞追蹤。已經(jīng)進(jìn)行了多種細(xì)胞培養(yǎng)容器設(shè)計(jì)，向細(xì)胞10-12提供趨化梯度，對(duì)細(xì)胞成像和監(jiān)測(cè)。

 

這些血管中的細(xì)胞可以提供實(shí)際問(wèn)題。目前，最常用的活細(xì)胞成像裝置是具有足夠放大倍數(shù)的顯微鏡和用于調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件的臺(tái)面培養(yǎng)箱。雖然這些顯微鏡具有精確成像和細(xì)胞跟蹤所需的光學(xué)特性，但在使用這種設(shè)置進(jìn)行活細(xì)胞成像時(shí)存在實(shí)際問(wèn)題。與專(zhuān)用培養(yǎng)箱相比，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)條件的調(diào)節(jié)對(duì)變化更敏感。13,14此外，圖像僅在某些時(shí)間點(diǎn)捕獲，但顯微鏡無(wú)法用于其他用戶在此期間的（端點(diǎn)）成像整個(gè)實(shí)時(shí)成像實(shí)驗(yàn)。可以克服這些問(wèn)題的系統(tǒng)是 CytoSMART® Lux3 BR Duo 試劑盒。這種用于活細(xì)胞成像的專(zhuān)用系統(tǒng)適用于常規(guī)培養(yǎng)箱，因此可以在恒定和最佳的培養(yǎng)環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)監(jiān)測(cè)。 這些設(shè)備的光學(xué)特性提供了高質(zhì)量的成像，以及準(zhǔn)確的細(xì)胞追蹤。通過(guò)將同一培養(yǎng)箱內(nèi)的兩個(gè)設(shè)備連接到一臺(tái)筆記本電腦，可以同時(shí)監(jiān)測(cè)和比較兩種培養(yǎng)物，而無(wú)需為其他實(shí)驗(yàn)室成員占用顯微鏡。

 

在這項(xiàng)概念驗(yàn)證研究中，我們使用并排的高質(zhì)量活細(xì)胞成像來(lái)確定 FBS 梯度對(duì)癌細(xì)胞系定向遷移的影響。使用ibidi µ-Slide Chemotaxis, CytoSMART® Lux3 BR Duo Kit 用于監(jiān)測(cè)暴露于 FBS 梯度或恒定 FBS 濃度的兩種癌細(xì)胞系。隨著時(shí)間的推移跟蹤細(xì)胞，這提供了對(duì)癌細(xì)胞趨化遷移的基本見(jiàn)解，這可能最終與癌癥轉(zhuǎn)移有關(guān)。
 

ibidi 80326

 

圖 1：實(shí)驗(yàn)設(shè)置。將癌細(xì)胞系接種在 Ibidi µ-Slide Chemotaxis 中并添加培養(yǎng)基，從而產(chǎn)生 FBS 梯度或恒定 FBS 濃度。使用 CytoSMART® Lux3 BR Duo 試劑盒監(jiān)測(cè)培養(yǎng)物 24 小時(shí)，成像間隔為 5 分鐘。

 

材料和方法：

在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下，將 HeLa 細(xì)胞（Innoprot P20107）和 C6 細(xì)胞（ATCC CCL-107）在補(bǔ)充有 10% FBS (Gibco) 和 1% pen-strep (Gibco) 的 DMEM (Gibco) 中培養(yǎng)至亞融合 (37 °C；5% CO2)。每個(gè)癌細(xì)胞系以每通道 18,000 個(gè)細(xì)胞（6 µl 細(xì)胞懸浮液；300 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/ml；含 10% FBS 的培養(yǎng)基）接種在 Ibidi µ-Slide Chemotaxis 中。將 65 µl 培養(yǎng)基（DMEM、FBS、pen-strep）添加到兩邊水庫(kù)中：一個(gè)水庫(kù)中的 20% FBS 和另一個(gè)水庫(kù)中的 0% FBS 或兩個(gè)水庫(kù)中的 10% FBS（圖 1）。使用 CytoSMART® Lux3 BR Duo 試劑盒（37°C；5% CO2）制作培養(yǎng)物的高質(zhì)量圖像：監(jiān)測(cè)培養(yǎng)物 24 小時(shí)，每 5 分鐘拍攝一次快照。然后，從 CytoSMART® Cloud 導(dǎo)出圖像，并使用 FIJI 插件 TrackMate 跟蹤單個(gè)細(xì)胞。15使用 FIJI 插件 Chemotaxis 和遷移工具將跟蹤的路徑轉(zhuǎn)換為趨化圖。16

結(jié)果：

圖 2（HeLa 細(xì)胞）和圖 3（C6 細(xì)胞）中顯示了具有 FBS 梯度或恒定 FBS 濃度的培養(yǎng)物的延時(shí)圖像。HeLa 細(xì)胞在恒定 FBS 濃度下從它們的起源遷移了更遠(yuǎn)的距離，但表現(xiàn)出略微傾向于向更高的遷移暴露于梯度時(shí)的 FBS 濃度。在恒定的 FBS 濃度下，C6 細(xì)胞似乎從原點(diǎn)遷移的距離更小。然而，這些細(xì)胞在 FBS 梯度中也顯示出較少的定向遷移 - 因此沒(méi)有明顯的趨化遷移。

圖 2：HeLa 細(xì)胞在恒定 FBS 濃度下遷移更大的距離，但在暴露于梯度時(shí)更傾向于向更高的 FBS 濃度遷移。A) 使用 CytoSMART® Lux3 BR Duo Kit 制作的 HeLa 細(xì)胞原始圖像，使用 FIJI 插件 TrackMate 進(jìn)行單細(xì)胞檢測(cè)（紫色）和路徑檢測(cè)（黃色）。B) 使用 FIJI 插件趨化性和遷移工具可視化的 HeLa 細(xì)胞的趨化位移，縱向和橫向位移相對(duì)于 FBS 梯度定義。

 

 

圖 3：C6 細(xì)胞在 FBS 梯度中沒(méi)有顯示出明顯的趨化遷移。A) 使用 CytoSMART® Lux3 BR Duo 試劑盒制作的 C6 細(xì)胞原始圖像，使用 FIJI 插件 TrackMate 進(jìn)行單細(xì)胞檢測(cè)（紫色）和路徑檢測(cè)（黃色）。B) 使用 FIJI 插件趨化性和遷移工具可視化的 C6 細(xì)胞的趨化位移，縱向和橫向位移相對(duì)于 FBS 梯度定義。

 

討論：

癌癥轉(zhuǎn)移是癌癥相關(guān)死亡的主要原因，因此細(xì)胞遷移是癌癥研究的重要課題。高質(zhì)量的活細(xì)胞成像是準(zhǔn)確細(xì)胞追蹤的先決條件，它提供了對(duì)驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)移性細(xì)胞遷移機(jī)制的基本見(jiàn)解。這些機(jī)制之一是趨化性，其中細(xì)胞沿著趨化劑的梯度增加遷移。本研究旨在通過(guò) ibidi µ-Slide Chemotaxis和CytoSMART® Lux3 BR Duo 試劑盒使用并排高質(zhì)量活細(xì)胞成像來(lái)確定 FBS 梯度對(duì)癌細(xì)胞系定向遷移的影響。這些設(shè)備提供了可立即應(yīng)用于分析軟件的高質(zhì)量圖像，從而實(shí)現(xiàn)輕松準(zhǔn)確的單細(xì)胞跟蹤。從該跟蹤中可以看出，HeLa 細(xì)胞更傾向于向更高的 FBS 濃度遷移，而 C6 細(xì)胞則不太清楚。

 

宮頸癌是最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移性原發(fā)腫瘤之一，轉(zhuǎn)移灶見(jiàn)于例如骨、肝和肺組織。17膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移是一種非常罕見(jiàn)的現(xiàn)象。18,19這些轉(zhuǎn)移中的每一個(gè)的臨床患病率都可能與血清的多少有關(guān) - 在本研究中由 FBS 建模– 作為細(xì)胞的化學(xué)引誘劑。由于通過(guò)血流擴(kuò)散是轉(zhuǎn)移17的主要機(jī)制，因此腫瘤細(xì)胞向血管的定向遷移和可能的趨化遷移可引發(fā)轉(zhuǎn)移。與神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系 C6 相比，在本研究中顯示出更多趨化遷移的宮頸癌細(xì)胞系 HeLa 似乎與相應(yīng)轉(zhuǎn)移的臨床患病率一致。

 

在本研究中用作化學(xué)引誘劑的 FBS 提供了一個(gè)實(shí)驗(yàn)上簡(jiǎn)單的模型系統(tǒng)。除此之外，這種設(shè)置模擬了向血管的定向遷移。然而，F(xiàn)BS 具有可變且復(fù)雜的組成 20，因此對(duì)負(fù)責(zé)所研究細(xì)胞定向遷移的特定分子幾乎沒(méi)有提供任何了解。還應(yīng)考慮到 FBS 具有除趨化遷移外影響細(xì)胞行為的其他特性：例如，細(xì)胞培養(yǎng)物中的 FBS 濃度會(huì)影響細(xì)胞增殖。21盡管在高 FBS 濃度和低 FBS 濃度下增殖率沒(méi)有明顯差異觀察到，細(xì)胞遷移可能仍然受到其他 FBS 相關(guān)過(guò)程的影響。因此，在相同設(shè)置下的后續(xù)實(shí)驗(yàn)，使用單個(gè)化學(xué)引誘劑可以提供有關(guān)細(xì)胞行為的更詳細(xì)信息。

 

結(jié)論：

在這項(xiàng)研究中，我們成功地展示了使用高質(zhì)量活細(xì)胞成像進(jìn)行準(zhǔn)確細(xì)胞追蹤的可能性。 ibidi µ-Slide Chemotaxis，CytoSMART® Lux3 BR Duo Kit 能夠并行監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)條件，并提供直接適用于細(xì)胞追蹤的圖像。這揭示了趨化性。

HeLa 細(xì)胞在 FBS 梯度中的遷移，而 C6 細(xì)胞沒(méi)有顯示出明顯的趨化遷移。高質(zhì)量的成像和相應(yīng)的結(jié)果最終可能與癌癥轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)研究相關(guān)。

 

參考文獻(xiàn)：

 

[1] World Health Organization (2021). Fact sheet: Cancer. Retrieved from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer.

 

[2] Roussos ET, Condeelis JS, Patsialou A (2011). Chemotaxis in cancer. Nat Rev Cancer, 11(8), 573-587.

 

[3] Iijima M, Huang YE, Devreotes P (2002). Temporal and spatial regulation of chemotaxis. Dev Cell, 3(4), 469-478.

 

[4] Sugihara K, Saito T, Okadome M, Sonoda K, Kobayashi H, Kamura T, Tsukamoto N, Nakano H (1994). The promotion of invasion

through the basement membrane of cervical carcinoma cells by fibronectin as a chemoattractant. Cancer Lett, 79(2), 167-173.

 

[5] Sun Y, Cheng Z, Ma L, Pei G (2002). β-Arrestin2 is critically involved in CXCR4-mediated chemotaxis, and this is mediated by its enhancement of p38 MAPK activation. J Biol Chem, 277(51), 49212-49219.

 

[6] Montana V, Sontheimer H (2011). Bradykinin promotes the chemotactic invasion of primary brain tumors. J Neurosci, 31(13),

4858-4867.

 

[7] Hayman EG, Ruoslahti E (1979). Distribution of fetal bovine serum fibronectin and endogenous rat cell fibronectin in extracellular matrix. J Cell Biol, 83, 255-259.

 

[8] Marques CS, Soares M, Santos A, Correia J, Ferreira F (2017). Serum SDF-1 levels are a reliable diagnostic marker of feline mammary carcinoma, discriminating HER2-overexpressing tumors from other subtypes. Oncotarget, 8(62), 105775.

 

[9] Zhou Y, Wang W, Wei R, Jiang G, Li F, Chen X, Wang X, Long S, Ma D, Xi L (2019). Serum bradykinin levels as a diagnostic marker in cervical cancer with a potential mechanism to promote VEGF expression via BDKRB2. Int J Oncol, 55(1), 131-141.

 

[10] Guy JB, Espenel S, Vallard A, Battiston-Montagne P, Wozny AS, Ardail D, Alphonse G, Rancoule C, Rodriguez-Lafrasse C, Magne, N. (2017). Evaluation of the cell invasion and migration process: a comparison of the video microscope-based scratch wound assay and the boyden chamber assay. J Vis Exp, 129, e56337.

 

[11] Nogalski MT, Chan GC, Stevenson EV, Collins-McMillen DK, Yurochko ADA (2012). Quantitative evaluation of cell migration by the phagokinetic track motility assay. J Vis Exp, 4(70), e4165.

 

[12] Chen Y-C, Allen SG, Ingram PN, Buckanovich R, Merajver SD, Yoon E (2015). Single-cell migration chip for chemotaxis-based microfluidic selection of heterogeneous cell populations. Sci Rep, 5, 9980.

 

[13] Frigault MM, Lacoste J, Swift JL, Brown CM (2009). Live-cell microscopy–tips and tools. J Cell Sci, 122(6), 753-767.

 

[14] Ettinger A, Wittmann T (2014). Fluorescence live cell imaging. Methods Cell Biol, 123, 77-94.

 

[15] Tinevez J-Y, Perry N, Schindelin J, Hoopes GM, Reynolds GD, Laplantine E, Bednarek SY, Shorte SL, Eliceiri KW (2017). TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods, 115, 80–90.

 

[16] Ibidi (n.d.). Chemotaxis and Migration Tool. Retrieved from: https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-andmigration-tool.html.

 

[17] NIH – National Cancer Institute (2020). Metastatic Cancer: When Cancer Spreads. Retrieved from: https://www.cancer.gov/

types/metastatic-cancer.

 

[18] Alvord EC (1976). Why do gliomas not metastasize?. Arch Neurol, 33(2), 73-75.

 

[19] Lun M, Lok E, Gautam S, Wu E, Wong ET (2011). The natural history of extracranial metastasis from glioblastoma multiforme.               

J Neurooncol., 105(2), 261-273.

 

[20] van der Valk J, Bieback K, Buta C, Cochrane B, Dirks W, Fu J, Hickman JJ, Hohensee C, Kolar R, Liebsch M, Pistollato F, Schulz M, Thieme D, Weber T, Wiest J, Winkler S, Gstraunthaler G (2018). Fetal bovine serum (FBS): past–present–future. Altex, 35, 99-118.

 

[21] Ibrahim B, Stange J, Dominik A, Sauer M, Doss S, Eggert M (2020). Albumin promotes proliferation of G1 arrested serum starved hepatocellular carcinoma cells. PeerJ, 8, e8568.