許多表達Cre的品系在構(gòu)建小鼠模型時均有著不明顯或未表征的表型。
 
而其中的一些表型（包括意外表達模式和不可預測的刪除效率）可能會讓實驗人員很難對實驗作出解釋，由此導致Cre-lox神話破滅。
 
那么，要如何解決這些問題呢？
   
 
脫靶Cre表達

當Cre不在驅(qū)動Cre表達的啟動子直接支配下表達在其他組織或器官中時，就會發(fā)生脫靶Cre表達。 
 
如果Cre品系發(fā)生這種情況，而實驗人員又無法發(fā)現(xiàn)，那么floxed小鼠基因可能會在意想不到的組織中被刪除。 
 
因此：需要充分了解cre品系的表達模式
   
 
生殖系中的脫靶Cre表達
 
生殖系中的脫靶Cre表達可能會特別棘手，因為您的鼠群中可能會出現(xiàn)所有細胞中都有完全重組的敲除等位基因的小鼠。
 
通常，生殖系表達Cre是因為減數(shù)分裂后卵母細胞中持續(xù)存在Cre RNA或蛋白質(zhì)。
 
對于許多Cre品系（不是全部）
   
 
LoxP位點重組效率低下

Cre重組loxP位點的效率受loxP位點在基因組內(nèi)的位置以及它們之間距離的影響。因此，相同Cre轉(zhuǎn)基因切割不同loxP等位基因的效率可能不同。
 
如果您發(fā)現(xiàn)loxP基因沒有被有效切割（也就是您的floxed 鼠靶標的基因表達水平?jīng)]有被充分降低），這可能會非常令人沮喪，那該怎么做呢？
 
1  步驟一
如果您發(fā)現(xiàn)自己遇到了這種情況，應重新對小鼠進行基因分型（使用新DNA樣本），確認您的小鼠是loxP等位基因純合子并攜帶Cre轉(zhuǎn)基因。 
 
2  步驟二
接下來，檢查您測試刪除效率/基因表達所用的方法，確保其適用于您的特異性loxP等位基因。
 
比如，如果條件性等位基因使loxP位點位于目標基因外顯子5的位置，則在重組后，外顯子5會被刪除，但外顯子1-4和啟動子會保持完整，并且仍可產(chǎn)生重組基因座的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
 
如果監(jiān)測mRNA表達的引物落在外顯子5的上游區(qū)域，您可能看不到表達水平顯著下降。 
 
3  步驟三
如果您確認Cre未有效切割您的loxP基因，應嘗試將目標基因的完整敲除等位基因引入鼠群，獲得攜帶目標基因復合雜合子（一個loxP側(cè)翼等位基因和一個敲除等位基因）及Cre轉(zhuǎn)基因的小鼠。
 
在這些小鼠中，Cre只需重組一個loxP等位基因即可，而不是兩個，這樣可以提高其重組效率。
 
 
他莫昔芬誘導的Cre品系

如果您的Cre品系是他莫昔芬誘導的Cre品系，則按照上述步驟1和2操作。
 
接下來，將他莫昔芬誘導的Cre品系與Cre報告基因品系進行雜交。  在Cre陽性、報告基因陽性小鼠中測試您的他莫昔芬給藥方案，確認他莫昔芬能否到達目標組織/器官并有效誘導重組。
 
事實上，最好在實驗開始時就這樣做，以便提前制定他莫昔芬誘導方案。
   
如果清楚了解所有這些步驟，則如上所述（步驟3）引入完整敲除等位基因或許可以提高他莫昔芬依賴性重組效率。
 
 
自發(fā)性Cre表型

Cre可能會自行產(chǎn)生表型，這會使數(shù)據(jù)解釋變得更加困難。
 
造成這種情況的原因可能是Cre轉(zhuǎn)基因插入位點對附近內(nèi)源基因有影響。
 
另外，由于小鼠基因組中的隱性半同源loxP位點之間重組會造成“Cre 毒性”，因此，Cre高表達的小鼠可能會出現(xiàn)突變表型或死亡。  
 
為了確保您觀察到的所有表型是由于目標基因被刪除而不是Cre轉(zhuǎn)基因引起的，您需要在實驗中納入攜帶相應loxP等位基因的野生型Cre陽性小鼠作為對照小鼠。
 
在創(chuàng)建下一個條件性敲除模型之前，您應該熟悉要使用的品系中Cre的表達模式。

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