攻克甜蜜負擔，盤點糖尿病研究常用的動物模型
糖尿病作為一種慢性代謝性疾病，通常不會在患者身上獨立存在，而常與其他諸多非健康狀態(tài)或疾病并存，在這個數(shù)病齊發(fā)的過程中糖尿病往往是“開路先鋒”，據(jù)統(tǒng)計全球高達4億多人飽受糖尿病困擾，其中我國糖尿病患病人數(shù)居全球之首，已超1.3 億。為了解決糖尿病這個“甜蜜負擔”，我們需要探究糖尿病的發(fā)病機制，針對每一類糖尿病構建合適的動物模型，開發(fā)對癥的藥物。今天，小編就為大家介紹一下糖尿病研究常用的模型。
圖1.全球糖尿病患者統(tǒng)計
01糖尿病簡介
糖尿病是以高血糖為特征的慢性代謝性疾病，且難以治愈一般需要終生服藥。糖尿病的可怕在于其會導致眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)等組織器官的慢性損傷和功能障礙，并有概率引起各種并發(fā)癥，如失明、腎衰竭、心臟病、中風和下肢截癱等。據(jù)《中國2型糖尿病防治指南（2020版）》指出，我國糖尿病患病率已上升至11.2%，也就是說我國每10個成年人就有1個糖尿病患者，這對個人和社會都是沉重的負擔[1]。
圖2.糖尿病并發(fā)癥
臨床上對于糖尿病的病因分型，目前應用最為廣泛、大體上最被公認是1999年世界衛(wèi)生組織（WHO）公布的這4類，即1型糖尿�。═1DM）、2型糖尿�。═2DM）、特殊類型糖尿病和妊娠期糖尿�。℅DM）。2019年WHO又在此基礎上，將成人隱匿性自身免疫糖尿�。↙ADA）和酮癥傾向T2DM歸類為“混合型糖尿病”，且添加了“未分類糖尿病”，從而將糖尿病分為6種類型[5]。每種類型糖尿病的特征如下：
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T2DM是糖尿病患者中最主要的群體，其主要發(fā)病原因是胰島素抵抗及胰島素分泌相對不足。
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T1DM是由于胰島β細胞破壞、胰島素分泌缺乏所致，特征是胰島功能差，終身需要依賴胰島素治療。
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繼發(fā)性糖尿病是一類由特定疾病或藥物等相關因素引起血糖升高的糖尿病類型。
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GDM是指與妊娠狀態(tài)相關的糖代謝異常，但未達到非孕人群糖尿病診斷標準，GDM患者糖代謝多數(shù)于產(chǎn)后能恢復正常，但將來患II型糖尿病概率也會增加。
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單基因糖尿病由影響胰島β細胞發(fā)育、功能或胰島素作用的單個基因突變所致，約占所有糖尿病的1%~5%，迄今已發(fā)現(xiàn)70余個單基因糖尿病的致病基因，大多數(shù)通過影響胰島β細胞功能而致血糖異常。
- 未定型糖尿病指部分糖尿病患者表現(xiàn)不典型，根據(jù)其癥狀、體征和已經(jīng)完成前述的胰島功能、胰島自身抗體及基因檢測等結果仍不能分型者。
02 糖尿病動物模型
糖尿病實驗動物模型作為重要的科研工具，在糖尿病機理研究，藥物篩選以及藥物臨床前實驗都發(fā)揮了重要作用。目前，隨著生物醫(yī)學技術的不斷進步，糖尿病動物模型造模所用的實驗動物種類和造模手段日呈多元化發(fā)展，糖尿病動物模型的構建也能更好地模擬人類糖尿病的發(fā)生發(fā)展。針對不同因素導致的糖尿病，研究人員應選擇與之研究主體相接近的糖尿病模型作為研究對象。小編在此歸納總結了當前糖尿病研究的主要嚙齒類模型，以饗讀者。
圖3.小鼠模型
2.1 自發(fā)性糖尿病模型
自發(fā)性糖尿病動物模型是指在自然條件下，未經(jīng)過人工處理而發(fā)生糖尿病的實驗動物，且其后代仍大概率患糖尿病。常見的自發(fā)性糖尿病有NOD小鼠、ob/ob小鼠、db/db小鼠、BB大鼠、LETL大鼠等。自發(fā)性模型動物糖尿病的發(fā)生發(fā)展進程與人類的糖尿病相似，在糖尿病研究上應用廣泛，常用自發(fā)性糖尿病大小鼠模型如下表所示。
2.2 誘發(fā)性糖尿病模型
化學藥物誘導：已發(fā)現(xiàn)多種化合物可在動物模型誘發(fā)糖尿病，其中鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)和四氧嘧啶(Alloxan,ALX)是最常用的，這兩種藥物都是細胞毒性葡萄糖類似物，對GLUT2轉運體具有高度親和力，主要破壞胰島β細胞[2]。比起ALX，STX因其具有更好的穩(wěn)定性和更小的毒性而更受歡迎。若在大小鼠懷孕期間，進行STZ誘導則可以構建GDM模型。但這種方法存在一定的風險，可能導致孕鼠流產(chǎn)，且STZ對胰島的破壞是不可逆的，而一般GDM患者血糖在產(chǎn)后能恢復正常，因此實驗動物可以在產(chǎn)后再移植一個正常的胰島，但是這個手術難度高且成本不菲。
圖4.STZ破壞胰島β細胞原理圖[6]
飲食誘導（DIO）：飲食誘導的動物糖尿病模型與人類糖尿病相似，常用來研究飲食、基因等因素與肥胖/糖尿病等疾病進程之間的關系。例如C57BL/6小鼠持續(xù)高脂飲食飼喂14周左右，檢測糖尿病相關指標，這類模型可用于肥胖、II型糖尿病研究。
圖5.DIO肥胖小鼠
手術誘導：直接全部或大部分切除實驗動物的胰腺，如果連續(xù)兩天血糖值超11.1mmol/L或者葡萄糖耐量試驗120min時的血糖值仍未恢復到注射前水平則認為DM造模成功。該技術必需經(jīng)過專門技術訓練且需配套的手術設備，還需消除外分泌胰腺消化酶和其他胰島激素的混雜效應的影響，因此其廣泛應用受到限制[4]。
2.3 基因修飾糖尿病模型
利用基因修飾技術對特定DNA片段進行定點敲除、敲入以及替換來實現(xiàn)基因表達的上調(diào)或下調(diào)，從而構建相關基因型的糖尿病動物模型。這類模型可以穩(wěn)定遺傳，有利于研究糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)病機制，并可用于糖尿病藥物的篩選和藥理藥效研究。
Ins2-C96Y點突變小鼠
研究發(fā)現(xiàn)若小鼠胰島素A鏈中的第七個氨基酸Cys96（TGC）變?yōu)門yr（TAC），會導致胰島素A鏈和B鏈之間的一個關鍵二硫鍵無法形成，從而導致小鼠proinsulin-2蛋白的錯誤折疊這些錯誤折疊的蛋白的積累最終會導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和胰島β細胞凋亡[3]。這個突變是Akita小鼠自發(fā)糖尿病的原因，據(jù)此我們構建了Ins2-C96Y點突變小鼠模型，并觀察到從4周齡開始，Ins2-C96Y雜合子小鼠就表現(xiàn)出多食、多飲、高血糖、體重不增的明顯糖尿病癥狀，且癥狀隨著年齡增長而加重，上述研究結果表明Ins2-C96Y小鼠可作為I型糖尿病研究的動物模型。
Ins2-C96Y的詳細介紹可以移步我們往期推文：
疾病小鼠模型系列之I型糖尿病篇（上）
圖6.Akita小鼠發(fā)病基本原理
胰腺特異性敲除PRLR小鼠
孕鼠STZ誘導構建GDM模型的難度較高，因此有研究者嘗試構建基因修飾的GDM模型。2019年，NteebaJ等構建了PRLR-flox小鼠，催乳素受體（PRLR）是孕期維持體內(nèi)血糖穩(wěn)態(tài)的關鍵分子，敲除PRLR基因能導致妊娠期β細胞不能正常擴增，體內(nèi)葡萄糖穩(wěn)態(tài)受損。將PRLR-flox小鼠和pdx1-Cre（胰島特異性Cre工具鼠）交配，得到的陽性子代在懷孕時能成功觀察到GDM的表型[10]。
GK/IRS-1雙基因敲除小鼠
IRS-1-/-小鼠表現(xiàn)為胰島素抵抗，但由于β細胞代償性增生，胰島素分泌增多，糖耐量正常。β細胞特異GK表達降低的小鼠，顯示輕度糖耐量異常。兩者雜交產(chǎn)生的GK/IRS-1雙基因剔除小鼠，表現(xiàn)Ⅱ型糖尿病癥狀，既有胰島素抵抗又有糖耐量異常。
Gck敲除/Hnf4a敲除/Abcc8敲除等模型
Gck、Hnf4a、Abcc8等基因與胰島β細胞發(fā)育、功能或胰島素信號通路有關，這些由基因突變導致的糖尿病統(tǒng)稱為單基因糖尿病。它們的臨床癥狀與T2DM和T1DM類似，常被誤診，導致患者得不到正確的治療。
· 葡糖激酶基因（Gck）被稱為“葡萄糖感受器”，不僅是糖代謝過程中關鍵的限速酶，在β細胞中它還可以通過感受血糖水平調(diào)節(jié)胰島素的分泌。Gck突變會導致輕度空腹血糖升高和輕度胰島分泌功能異常[9]。
· Hnf4a主要表達于肝臟，但在胰腺和腎臟上也有表達，該基因編碼的轉錄因子通過多種途徑影響糖代謝，Hnf4a突變會導致高胰島素血癥和巨大兒的癥狀[10]。
· Abcc8基因編碼在胰島素分泌中起重要作用的KATP通道的SUR1調(diào)節(jié)亞單位，其突變可影響鉀離子通道關閉和β細胞膜的去極化、抑制胰島素分泌，導致常染色體顯性遺傳性糖尿病[11]。
構建上述關鍵基因的敲除模型和條件性敲除模型，可用于單基因糖尿的機制研究，是提高單基因糖尿病個體化精準診治水平的關鍵。
GLP-1R人源化模型
胰高血糖素樣肽-1受體（glucagon-like peptide-1 receptor, GLP-1R）廣泛分布在胰島、胃、小腸、心臟、腎臟、肺、大腦等組織器官中， 當它被GLP-1或人工合成的GLP-1R激動劑激活后，便能發(fā)揮多種不同的生理功能。GLP-1R的主要作用是和胰高血糖素樣肽-1結合，調(diào)節(jié)血糖，它是治療2型糖尿病最有效的靶點之一[8]。如果能在小鼠上敲入人源的GLP-1R基因，讓小鼠表達人源GLP-1R，就可以直接使用小鼠來篩選糖尿病藥物，并初步分析候選藥物的藥理藥效，把曾經(jīng)要到志愿者身上才能驗證的一些藥物性能提前到小鼠上實現(xiàn)，可以大大節(jié)約藥物開發(fā)的成本和時間。
關于GLP-1R人源化模型的詳細介紹可以查閱我們的往期推文：
GLP-1R丨2型糖尿病治療的明星靶點
圖7.GLP-1R的生理功能
03 優(yōu)吉鼠庫糖尿病動物模型
南模生物優(yōu)吉鼠模型資源庫含多種自主構建的基因修飾糖尿病研究模型，可用于糖尿病的基礎研究和藥物開發(fā)，詳細模型信息見下表：
*：疾病預測數(shù)據(jù)是基于已發(fā)表文獻中的近似模型 （與公司模型具有相似的構建策略或基因型）預測獲得。
南模生物深耕基因編輯領域，提供全方位模式生物服務，包括基因修飾成品模型供應、個性化模型定制、飼養(yǎng)繁育、表型分析、藥效評價等，滿足不同實驗室需求。
參考文獻：
[1]中國2型糖尿病防治指南（2020版）
[2]KachapatiK,AdamsD,BednarK,etal.Thenon-obesediabetic(NOD)mouseasamodelofhumantype1diabetes.MethodsMolBiol.2012;933:3-16.
[3]LeMayC,ChuK,HuM,etal.Estrogensprotectpancreaticbeta-cellsfromapoptosisandpreventinsulin-deficientdiabetesmellitusinmice.ProcNatlAcadSciUSA.2006Jun13;103(24):9232-7.
[4]KleinertM,ClemmensenC,HofmannSM,etal.Animalmodelsofobesityanddiabetesmellitus.
NatureReviewsEndocrinology,2018,14(3).
[5]https://www.who.int/zh/news-room/fact-sheets/detail/diabetes
[6]WuJ,YanLJ.Streptozotocin-inducedtype1diabetesinrodentsasamodelforstudyingmitochondrialmechanismsofdiabeticβcellglucotoxicity.
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[7]NteebaJ,KubotaK,WangW,etal.
Pancreaticprolactinreceptorsignalingregulatesmaternalglucosehomeostasis.JEndocrinol.
2019;241(1):71–83.doi:10.1530/JOE-18-0518
[8]Laviola L, Leonardini A, Melchiorre M, et al. Glucagon-like peptide-1 counteracts oxidative stress-dependent apoptosis of human cardiac progenitor cells by inhibiting the activation of the c-Jun N-terminal protein kinase signaling pathway. Endocrinology, 2012, 153 : 5770–5781. DOI:10.1210/en.2012-1461
[9]McDonald, T. J. & Ellard, S. Maturity onset diabetes of the young: identification and diagnosis. Annals of clinical biochemistry 50,403-415,doi:10.1177/0004563213483458 (2013).
[10] Anik, A., Catli, G., Abaci, A. & Bober, E. Maturity-onset diabetes of the young (MODY): an update. Journal of pediatric endocrinology & metabolism : JPEM 28, 251-263, doi:10.1515/jpem-2014-0384 (2015).
[11]Wen, X. & Yang, Y. Emerging roles of GLIS3 in neonatal diabetes, type 1 and type 2 diabetes. Journal of molecular endocrinology 58, R73-R85, doi:10.1530/JME-16-0232 (2017).
