10x Genomics 的Visium FFPE 空間轉(zhuǎn)錄組自2021年5月推出以來(lái)，很多研究FFPE樣本的科學(xué)家踴躍開展實(shí)驗(yàn)，這不到一年的時(shí)間，全球首篇FFPE空間轉(zhuǎn)錄組的文章就發(fā)表啦，真是可喜可賀！今天，小編就為您分享一下這篇大作！

文章題目：Tertiary lymphoid structures generate and propagate anti-tumor antibody-producing plasma cells in renal cell cancer

發(fā)表時(shí)間：2022年3月

發(fā)表期刊：Immunity

影響因子：31.428

發(fā)表單位：法國(guó)索邦大學(xué)Cordeliers研究院

自身免疫性疾病、慢性感染、移植物排斥和癌癥中長(zhǎng)期炎癥和抗原持久性的組織中存在三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)（TLS）。腫瘤內(nèi)的TLS與愈后是否良好相關(guān)。TLS是在成纖維細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)上形成的淋巴聚集體，包括一個(gè)T細(xì)胞區(qū)，以及一個(gè)B細(xì)胞區(qū)。成熟的TLS存在一個(gè)中心（GC），其中包含T濾泡輔助（Tfh）細(xì)胞和與B細(xì)胞密切接觸的濾泡樹突狀細(xì)胞。一些研究表明，含GC的成熟TLS，與臨床預(yù)后有關(guān)。這在肝細(xì)胞癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌和胰癌中都有驗(yàn)證。本研究針對(duì)ccRCC原發(fā)性腫瘤，作者做了12個(gè)冷凍切片空間轉(zhuǎn)錄組和12個(gè)FFPE切片空間轉(zhuǎn)錄組并結(jié)合BCR分析、多色免疫熒光等分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤中的三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)產(chǎn)生成熟B細(xì)胞，血漿細(xì)胞擴(kuò)散到腫瘤基部中，產(chǎn)生抗體與腫瘤細(xì)胞結(jié)合并引發(fā)其凋亡。

研究結(jié)果

1.空間腫瘤微環(huán)境揭示了TLS⁺腫瘤中富含B細(xì)胞的相關(guān)區(qū)域

為了分析TLS對(duì)腫瘤微環(huán)境影響，作者使用了來(lái)自10x的Visium空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)。本研究對(duì)12個(gè)冰凍和12個(gè)石蠟包埋的 ccRCC原發(fā)性腫瘤切片進(jìn)行了空間轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)。在對(duì)切片進(jìn)行H&E染色后，病理學(xué)家注釋了每個(gè)腫瘤組織以及TLS的定位。

下圖展示的是一個(gè)TLS Positive冷凍腫瘤、一個(gè)TLS Positive FFPE腫瘤和一個(gè)TLS negative冷凍腫瘤。碳酸酐酶9（蛋白質(zhì)名稱：CAIX，基因名稱：Ca9）是ccRCC腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志物，在腫瘤切片中均勻分布。如下圖所示，TLS+腫瘤中，B細(xì)胞譜系和T細(xì)胞基因在TLS區(qū)域內(nèi)優(yōu)先表達(dá)。與腫瘤組織的其他部分相比，TLS區(qū)域的B譜系和T細(xì)胞評(píng)分分布更高。TLS的單核細(xì)胞譜系略高，而NK細(xì)胞在整個(gè)腫瘤切片中分布更廣。內(nèi)皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞分布均勻，而纖維細(xì)胞在TLS區(qū)域的高表達(dá)。TLS與B譜系、T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞特征的表達(dá)有關(guān)。

圖1 腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞群的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果

 

2.TLS內(nèi)部和外部的免疫球蛋白（Ig）基因表達(dá)

為了確定TLS在腫瘤中的轉(zhuǎn)錄情況，在根據(jù)HE的結(jié)果定義TLS后，作者在TLS腫瘤區(qū)域之間進(jìn)行了差異基因表達(dá)分析。在與Ig基因（IGKC、JCHAIN）、IGG1和IGHA1基因相同的位置發(fā)現(xiàn)了成纖維細(xì)胞標(biāo)志物COL1A1的高表達(dá)。作者分析了CXCL12的表達(dá)�？傮w而言，作者總結(jié)了在TLS+腫瘤中，表達(dá)PC的IGG1和IGHA1預(yù)先轉(zhuǎn)移到TLS附近，并可能與成纖維細(xì)胞一起在腫瘤內(nèi)傳播。

 

3.空間B細(xì)胞受體（BCR）分析可識(shí)別原位超突變和克隆選擇

TLS中B細(xì)胞成熟亞型和PC的共定位暗示了原位B細(xì)胞適應(yīng)免疫而產(chǎn)生。在這種過(guò)程中，B細(xì)胞發(fā)生了突變細(xì)胞受體序列，并選擇和擴(kuò)展大多數(shù)克隆。

作者研究BCR的核苷酸序列。因?yàn)閂isium冰凍切片空間技術(shù)是基于Bracode的RNA測(cè)序，這使作者能夠查詢?cè)�始轉(zhuǎn)錄物并進(jìn)行空間BCR分析。作者使用MiXCR工具從Bulk水平5’RNA測(cè)序和3’ FF Visium 數(shù)據(jù)中識(shí)別BCR IgL和IgH克隆型及其種系超突變，捕獲大多數(shù)IGL和一些IGH序列的完整CDR3區(qū)域。

 

圖2 空間BCR剖析識(shí)別腫瘤區(qū)突變和克隆擴(kuò)增和傳播

研究發(fā)現(xiàn)，在TLS外的區(qū)域，大多是高度突變序列。盡管如此，在TLS內(nèi)區(qū)域測(cè)量了包括高度突變序列在內(nèi)的所有突變，而TLS外區(qū)域的大多數(shù)Ig轉(zhuǎn)錄物都富含高度突變序列，這表明細(xì)胞超突變發(fā)生在TLS中，并表明突變PC在整個(gè)腫瘤中傳播。

作者檢查了47個(gè)ccRCC腫瘤（包括由Visium的12個(gè)冷凍腫瘤）中bulk水平5’RNA序列的輕鏈和重鏈突變。為了確定細(xì)胞超突變是否伴有克隆型選擇，作者研究了大量bulk 水平5’ RNA-seq數(shù)據(jù)的IgH。高TLS的樣本表現(xiàn)出高總克隆數(shù)，同時(shí)超過(guò)100倍的克隆類型數(shù)比例更高。

最后，為了確定擴(kuò)增IgH克隆型的克隆關(guān)系和位置，作者對(duì)30個(gè)RNA-seq空間數(shù)據(jù)進(jìn)行了克隆性評(píng)估。作者證明了相應(yīng)的B細(xì)胞克隆的遷移。在TLS低樣本中，檢測(cè)到的克隆類型數(shù)量非常低，這也支持了腫瘤內(nèi)PC主要在TLS中生成的命題。

圖3 PC與成纖維細(xì)胞和IgG腫瘤染色在TLS+腫瘤中的共定位

總而言之，這些數(shù)據(jù)支持原位TLS介導(dǎo)的成熟發(fā)育、選擇、克隆擴(kuò)增過(guò)程，并且在腫瘤的各個(gè)區(qū)域傳播PC細(xì)胞。

 

4.血漿細(xì)胞沿著成纖維細(xì)胞軌跡從TLS傳播

為了分析腫瘤內(nèi)PC和成纖維細(xì)胞的位置以及CXCL12的原位表達(dá)，作者使用了FFPE腫瘤切片多色熒光標(biāo)記，多發(fā)性骨髓瘤癌基因1（MUM1）（IRF4）作為PC的特定標(biāo)記， COL1（Col1a）作為成纖維的特定標(biāo)記。

這些數(shù)據(jù)概括了Ig和成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)錄物的共同表達(dá)，以及成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)錄物和CXCL12的共同表達(dá)，并驗(yàn)證了PC在TLS內(nèi)和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)確定的成纖維細(xì)胞網(wǎng)狀細(xì)胞軌跡中的位置。

 

5.TLS和Ig產(chǎn)生PC與凋亡腫瘤細(xì)胞結(jié)合的IgG抗體有關(guān)，并對(duì)免疫治療有反應(yīng)

為了進(jìn)一步研究TLS、腫瘤內(nèi)PC和Ig的聯(lián)系，作者首先分析了TLS的成熟度。成熟的TLS特征是GC包含B細(xì)胞區(qū)，周圍是T細(xì)胞區(qū)，其中CD4+PD1+ T細(xì)胞、CD4+ PD1+CXCR5+ Tfh細(xì)胞和產(chǎn)生CXCL13的細(xì)胞被檢測(cè)到（如下圖）。

圖4 成熟的TLS+腫瘤顯示有更多的MUM1+ PC

作者進(jìn)一步研究了TLS成熟度標(biāo)記與57個(gè)TLS+樣品上MUM1+IgG+和MUM1+IgA+ PC密度的相關(guān)性。作者發(fā)現(xiàn)TLS具有CD23+ FDC、BCL6+細(xì)胞和PNAd+ HEV與MUM1+IgG+ PC和MUM1+IgA+ PC密度之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性。結(jié)合抗人類IgG在TLS+腫瘤中被觀察到，而在TLS腫瘤中沒(méi)有觀察到。對(duì)103個(gè)腫瘤的量化顯示，IgG陽(yáng)性率很高，與TLS腫瘤相比，TLS+的腫瘤細(xì)胞高達(dá)100%。在TLS+和TLS中都觀察到弱IgA（如下圖）。

圖5 與未成熟或沒(méi)有TLS的腫瘤相比，有TLS腫瘤的IgG+

CAIX+腫瘤細(xì)胞增加。這與腫瘤細(xì)胞死亡和對(duì)ICI的反應(yīng)有關(guān)

為了揭示腫瘤結(jié)合的IgG抗體的潛在功能，作者調(diào)查了腫瘤細(xì)胞中發(fā)生凋亡的跡象，凋亡細(xì)胞數(shù)量高，IgG腫瘤細(xì)胞比例很高。

為了評(píng)估IgG腫瘤對(duì)ICI治療患者的影響，作者評(píng)估了患者的35個(gè)NI治療的腫瘤患者和16個(gè)Nivolumab治療的腫瘤患者。與低IgG腫瘤細(xì)胞患者相比，高IgG腫瘤細(xì)胞患者的PFS要長(zhǎng)得多。 

 

總結(jié)

腫瘤的三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)（TLS）會(huì)影響癌癥免疫治療的效果。作者使用空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)來(lái)說(shuō)明腎細(xì)胞癌（RCC）TLS中B細(xì)胞的反應(yīng)。B細(xì)胞在TLS中富集，Visium可以識(shí)別B細(xì)胞向血漿細(xì)胞（PC）轉(zhuǎn)化過(guò)程中的所有階段。分析B細(xì)胞揭示TLS中的克隆多樣化、選擇、擴(kuò)增等過(guò)程，并且發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)端存在完全成熟的克隆類型。

在TLS+腫瘤中，產(chǎn)生IgG和IgA的PC沿著成纖維細(xì)胞軌跡傳播到腫瘤基部。TLS+腫瘤中產(chǎn)生了較多的IgG轉(zhuǎn)化來(lái)的PC、IgG以及凋亡惡性細(xì)胞，這表明抗腫瘤效應(yīng)的活性。免疫治療反應(yīng)相關(guān)的B細(xì)胞成熟和抗體產(chǎn)生的過(guò)程發(fā)生在腫瘤中的TLS，TLS可能具有抗腫瘤作用。這為腫瘤治療提供了全新的思路。