多種疾病的產(chǎn)生都伴隨著蛋白過度磷酸化的機制。研究磷酸化水平，以確定信號傳導。在不評估總蛋白磷酸化和非磷酸化水平的情況下，研究人員可能會得出錯誤的結(jié)論，即一種化合物具有上調(diào)或下調(diào)磷酸化的作用，而實際上其作用可能是由于該蛋白質(zhì)表達水平的變化。這種錯誤的分析結(jié)果導致對化合物的功能的判定。

HTRF®--均相時間分辨熒光，時間分辨（TRF）和熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）兩大核心技術(shù)的碰撞，利用兩個極其穩(wěn)定的熒光基團，“相遇即發(fā)光”的原理，提供了一個簡單（免洗），快速，高通量，高靈敏的方法分析磷酸化蛋白和總蛋白水平。

HTRF分析總蛋白和磷酸化蛋白
本研究進行了總AKT和磷酸化AKT Ser473檢測，由此提供總蛋白檢測重要性的依據(jù)。

實驗方法：所有檢測方法均采用標準的貼壁細胞雙板HTRF檢測方法進行。細胞與化合物在96孔板中孵育，裂解細胞，轉(zhuǎn)移到兩個不同的檢測板上，一個用于測量磷酸化AKT，另一個用于測量總AKT，并添加HTRF試劑進行檢測。

HEK293細胞用于100000個細胞/孔的所有AKT檢測。細胞與不同濃度的IGF-1孵育10分鐘；已知的蛋白質(zhì)合成抑制劑環(huán)己胺，孵育16小時。數(shù)據(jù)均以HTRF Ratio值和歸一化值表示。

用IGF-1處理細胞以劑量依賴的方式顯著增加了AKT Ser473磷酸化水平，EC50值為1.06nM。IGF-1也下調(diào)了AKT的表達，半抑制濃度值為0.8nM。使用兩種分析數(shù)據(jù)計算的歸一化值P-AKT/T-AKT顯示，在IGF-1刺激下，磷酸化的AKT與非磷酸化的AKT的比例顯著增加。

環(huán)己酰亞胺處理AKT磷酸化水平降低，且AKT表達水平降低，且半抑制濃度值相似。如果沒有進行總AKT檢測，并且只評估磷酸化AKT檢測結(jié)果，那么環(huán)己酰亞胺可能被錯誤地定義為AKT磷酸化的抑制劑。通過進行兩種分析和將數(shù)據(jù)表示為歸一化值，可以發(fā)現(xiàn)，AKT的磷酸化水平不受環(huán)己酰亞胺處理的調(diào)節(jié)。因此，環(huán)己酰亞胺可以被正確地識別為AKT表達的抑制劑，其半抑制濃度值為460nM，但它并不抑制磷酸化。

結(jié)合上述實驗結(jié)論，可以幫助我們進一步了解同時檢測磷酸化蛋白和總蛋白的重要性，正確并客觀的認定化合物對蛋白磷酸化水平的調(diào)節(jié)。
 

*同靶點有500test和10000test可提供。小編還有AlphaLISA技術(shù)磷酸化蛋白和總蛋白檢測試相關試劑盒可提供，詳情請咨詢優(yōu)寧維。

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