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利用熒光法檢測蛋白濃度的兩種方式

瀏覽次數(shù):3475 發(fā)布日期:2022-11-4  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)

蛋白質(zhì)定量是許多蛋白質(zhì)生物學(xué)工作流程的重要組成部分,是蛋白質(zhì)電泳、蛋白質(zhì)印跡、質(zhì)譜和免疫分析等常用技術(shù)之前的必要步驟。與傳統(tǒng)的BCA、Bradford等比色法測蛋白的方式相比,熒光法測蛋白動態(tài)范圍更寬、準(zhǔn)確性更高。


蛋白質(zhì)定量是許多蛋白質(zhì)生物學(xué)工作流程的重要組成部分,是蛋白質(zhì)電泳、蛋白質(zhì)印跡、質(zhì)譜和免疫分析等常用技術(shù)之前的必要步驟。與傳統(tǒng)的BCA、Bradford等比色法測蛋白的方式相比,熒光法測蛋白動態(tài)范圍更寬、準(zhǔn)確性更高。


試劑及儀器
• Qubit™ Protein Assay Kits(Thermo:Q33212)
• Qubit 4熒光計(jì)(Thermo)
• Fluo-200熒光計(jì)(奧盛)
• Feyond-A300多功能酶標(biāo)儀(奧盛)

方法
• 標(biāo)品配置

加樣體積 10μL
標(biāo)品配制 將試劑盒中最高濃度的400ng/uL蛋白標(biāo)品稀釋配制成300、200、100、50、25、12.5ng/uL共6個(gè)濃度,試劑盒濃度范圍在12.5 µg/mL 到 5 mg/mL。 


• 操作步驟
1.根據(jù)試劑說明書,制備染料Mix工作液及0、200及400ng/uL校準(zhǔn)點(diǎn)試劑,校準(zhǔn)曲線完成后,分別在Qubit4與Fluo-200上進(jìn)行檢測;

2.在96孔黑色平底微孔板的每孔中加入10uL標(biāo)品溶液后,每孔中再添加190uL的Mix工作液,混勻后避光5分鐘,開始儀器檢測,標(biāo)品與空白布局如圖1,儀器參數(shù)如表1。
 
表1 Feyond-A300參數(shù) 
 
試劑波長 EX/EM:470/525
PMT增益 中低
穩(wěn)定時(shí)間 150ms
積分時(shí)間 40μs


圖1. 樣品布局界面

結(jié)果
1.利用Feyond-A300的內(nèi)置數(shù)據(jù)處理軟件,將蛋白標(biāo)品濃度與熒光強(qiáng)度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合,采用四參數(shù)(4PL)擬合方式,得到曲線方程與曲線擬合度,R2接近為1(圖2)。 
 
         
圖2. 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲

2.濃度范圍在12.5 ng/uL~400ng/uL時(shí),F(xiàn)luo-200與Qubit4的檢測濃度偏差均在10%以內(nèi),是Qubit的合理偏差。除接近極限濃度的最低點(diǎn)外,F(xiàn)eyond-A300的檢測濃度與Qubit4相比也在合理偏差內(nèi),且與理論濃度更為接近(表2)。

表2 三款儀器的檢測數(shù)據(jù)
 
理論濃度 Qubit4 Fluo-200 Feyond-A300
12.5 20 19.11 8.023
25 33.2 30.59 29.319
50 50.6 46.16 50.626
100 95.2 92.94 101.835
200 184 192.39 197.206
300 286 299.71 302.978
400 400 401.22 398.596

總結(jié)
Qubit 熒光檢測蛋白試劑盒,不僅在Qubit儀器上可以適用,也可在Feyond-A300的熒光檢測功能上適用,并且準(zhǔn)確性基本無差異,熒光計(jì)檢測無需建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,僅需進(jìn)行標(biāo)品點(diǎn)的校準(zhǔn),便可直接進(jìn)行濃度的測試,簡單便捷。Feyond-A300的標(biāo)曲保存功能,亦可滿足該需求,僅需一次建立標(biāo)曲后,將標(biāo)曲保存于標(biāo)曲庫,后續(xù)僅需調(diào)取該標(biāo)曲便可直接給出未知樣品的濃度。
 
來源:杭州奧盛儀器有限公司
聯(lián)系電話:0571-88948289
E-mail:sales.china@allsheng.com

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