基于信使RNA（mRNA）的治療，簡單來講就是化學(xué)修飾后的的mRNA進入細胞后利用細胞內(nèi)的資源翻譯出機體所需的蛋白質(zhì)。然而，在mRNA進入機體那一刻到進入靶細胞的過程中，面臨著穩(wěn)定性、免疫原性、跨越多種生物屏障等的挑戰(zhàn)。為此，研究人員陸續(xù)開發(fā)出多種mRNA遞送系統(tǒng)，其中一種主流的遞送方式就是用于制備新冠疫苗的脂質(zhì)納米顆粒（LNP）技術(shù)。目前，除了熟知的疫苗外，通過蛋白替換、基因編輯等手段，LNP已在代謝疾病、癌癥等治療中展示出巨大的潛力。

在mRNA LNP開發(fā)過程中，明確其藥物代謝動力學(xué)（PK）-藥物效應(yīng)動力學(xué)（PD）關(guān)系至關(guān)重要。雖然LNP的體內(nèi)暴露是遞送、表達mRNA的前提條件，但暴露量與表達效果之間并不存在必然的聯(lián)系。局部注射的mRNA LNP可能會從注射部位遷移、積聚到機體的其它組織，高效轉(zhuǎn)染親和力較高的細胞，將mRNA攜帶的指令兌換成所需蛋白。例如，普遍認為肌內(nèi)注射的mRNA LNP主要靶向肌細胞，但事實上，在肝臟也能看到相當(dāng)?shù)牡鞍妆磉_。
為了探討mRNA LNP體內(nèi)分布狀況與PK之間的關(guān)系，來自上海交通大學(xué)的徐宇虹團隊構(gòu)建了攜帶螢火蟲熒光素酶（firefly luciferase）mRNA的LNP并利用DiR或氘代膽固醇進行標(biāo)記，通過生物發(fā)光成像以及熒光素酶活性測定來研究mRNA LNP的體內(nèi)表達情況、DiR熒光成像以及氘代膽固醇含量分析來追蹤mRNA LNP的體內(nèi)分布情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然經(jīng)肌肉注射進體內(nèi)的Fluc-mRNA LNP在注射部位的含量最高，該部位的轉(zhuǎn)染效果不如肝臟、脾臟和淋巴結(jié)，驗證了mRNA LNP生物分布與基因表達之間的非線性關(guān)系。

此外，這些LNP的生物分布、基因表達受給藥方式、顆粒大小等因素的影響。該研究結(jié)果發(fā)表在國際期刊《Pharmaceutical Research》上，題目為Biodistribution and Non-linear Gene Expression of mRNA LNPs Affected by Delivery Route and Particle Size。

肌肉注射后，mRNA LNP的體內(nèi)分布狀況
首先，作者將可電離脂質(zhì)H3、HSPC、膽固醇以及DMG-PEG 2000溶解到乙醇中，再把這些脂質(zhì)混合物快速注射到含EZ Cap™ firefly luciferase mRNA的水溶液中，得到Fluc-mRNA LNP。在制備上述脂質(zhì)混合物時，作者還會加入熒光染料DiR或氘代膽固醇進行標(biāo)記，以便追蹤mRNA LNP的體內(nèi)分布情況。


肌肉組織的熒光信號隨時間增加，在第48小時最強，而肝臟信號在第7小時達到峰值后逐漸減弱。

總體而言，mRNA LNP在體內(nèi)主要分布于肌肉組織，此次是肝臟。同樣地，通過LC/MS定量分析體內(nèi)不同部位的氘代膽固醇含量，并將每個部位的LNP%計算出來，有60~80% LNP都在肌肉組織，10~20%在肝臟，僅有1~2%在脾臟。

肌肉注射后，mRNA LNP的體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果
為了研究上述LNP運載的mRNA在聚集部位的釋放情況，作者將編碼卵清蛋白的OVAL-mRNA替代Fluc-mRNA，LNP肌肉注射2小時后收集肌肉組織，肝臟，引流淋巴結(jié)并使用Cy5標(biāo)記的寡核苷酸探針進行原位雜交。

結(jié)果顯示，在注射部位的肌細胞內(nèi)僅檢測出微弱的mRNA信號，而肝細胞和淋巴細胞內(nèi)的信號尤為清晰。

此外，以同樣的給藥方式將載有Fluc-mRNA的LNP注射到小鼠體內(nèi)后，研究人員不僅在注射部位，在肝臟也檢測到熒光素酶。熒光素酶活性測定數(shù)據(jù)（以組織的總重量對數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化處理）表明，Fluc-mRNA LNP在肝臟、脾臟和淋巴結(jié)的表達水平均高于肌肉組織。

不同給藥方式下，F(xiàn)luc-mRNA LNP的體內(nèi)分布、表達狀況
接下來，作者將DiR標(biāo)記的Fluc-mRNA LNP以3種不同的給藥方式注射到小鼠體內(nèi)，并比較了各組小鼠體內(nèi)Fluc-mRNA LNP的分布、表達狀況。其中，經(jīng)靜脈注射的mRNA LNP主要在肝臟積聚、表達，生物發(fā)光強度在第4小時達到峰值并在注射后48小時內(nèi)迅速減弱至背景水平。

相比之下，經(jīng)肌肉注射的mRNA LNP雖然有大部分停留在注射部位，但在注射部位和肝臟均能觀察到明顯的生物發(fā)光，而且，生物發(fā)光的時間、強度較前者慢、弱。至于皮下注射的mRNA LNP，主要在注射部位積聚、表達，生物發(fā)光強度最弱。

大小各異的Fluc-mRNA LNP的體內(nèi)分布、表達狀況
除給藥方式外，作者最后還探討了顆粒大小這個因素對Fluc-mRNA LNP體內(nèi)分布、表達的影響。在維持脂質(zhì)組成、mRNA/脂質(zhì)比率不變的前提下，制備了小、中、大3種尺寸的Fluc-mRNA LNP。

肌肉注射后，小的顆粒更容易遷移到肝臟，而大的顆粒會積聚于注射部位的肌肉組織。有趣的是，盡管小LNP在肝臟的濃度最高，但其轉(zhuǎn)染效果不如中LNP，大LNP效果最差。

總之，該研究揭示了mRNA LNP體內(nèi)分布與基因表達之間的非線性關(guān)系并明確了與之相關(guān)的影響因素。這些結(jié)果拓展了我們對mRNA LNP體內(nèi)狀況的認識，有望為高靶向性、高轉(zhuǎn)染效率mRNA LNP的開發(fā)提供新思路。