近年來，研究人員注意到細胞分選后細胞的變化，如形態(tài)學變化、細胞生長延遲、細胞活力降低以及基因表達的改變。這是因為傳統(tǒng)的細胞分選技術是空氣噴射法，這種分選方式很容易引發(fā)細胞分選后的細胞應激。如何降低或者避免這種分選后細胞應激現(xiàn)象的產(chǎn)生成為細胞分選的一大挑戰(zhàn)。

On-chip Sort 無損傷流式細胞分選儀是世界上首個利用微流控芯片技術進行細胞分選的儀器。這種技術很好的解決了傳統(tǒng)細胞分選儀可能出現(xiàn)的細胞損傷和細胞污染等問題。

On-chip Sort 技術的核心是使用一次性的小型微流控芯片，樣品和鞘液分別裝入芯片上的樣品池和鞘液池。傳統(tǒng)的細胞分選儀需要特定的鞘液，而On-chip Sort 可以選擇適合細胞的任何鞘液，例如培養(yǎng)基、淡水、海水和油等。

On-chip Sort 無損傷流式細胞分選儀通過“流動移位”機制進行，當檢測到目標細胞接近分選區(qū)域時，通過空氣加壓產(chǎn)生短的液體脈沖，將目標細胞轉(zhuǎn)移到收集池。而非目標細胞則繼續(xù)流動進入廢液池。這種分選的方法不涉及高壓、噴嘴產(chǎn)生靜電和細胞高速碰撞等問題，所以可以實現(xiàn)細胞無損傷分選。
 

在進行細胞分析和分選的過程中，所有的液體（包括樣品、鞘液和廢液）都保留在芯片內(nèi)，并不需要外部的儲液裝置。液體流動通道和儲液池中的液體都不會與儀器本身直接接觸，并且芯片也是無菌的，因此不會產(chǎn)生樣本間的污染和樣本與儀器之間的污染。

基于空氣噴射和反應池混合動力為原理的傳統(tǒng)細胞分選儀在進行細胞分選時的多個步驟都很容易對細胞造成破壞或誘導細胞產(chǎn)生應激反應。而On-chip Sort 無損傷流式細胞分選儀因為微流控芯片的設計，去除了一些可能會損傷細胞的步驟，并且關鍵還在于其分選壓力比傳統(tǒng)細胞分選儀低100多倍，因此可以進行更加溫和的細胞分選，對細胞無損傷。
 

On-chip Sort 被用于多種細胞類型的細胞分選，特別是一些非常“脆弱”的不能用其他細胞分選儀器分選的細胞。包括神經(jīng)細胞、iPS衍生細胞、轉(zhuǎn)染細胞、心肌細胞、肝細胞、精子細胞和脂肪細胞等。接下來，跟大家分享一些利用On-chip Sort 進行細胞分選的結(jié)果。


 

01.  分選對細胞生長的影響
為了比較傳統(tǒng)的細胞分選儀（空氣噴射法）和On-chip Sort（微流控分選法）對穩(wěn)定的HeLa細胞分選后的影響，分別用兩種細胞分選儀對100個HeLa細胞進行分選。分選后，將分選的細胞收集起來在96孔板上進行培養(yǎng)，并且每天對其進行細胞計數(shù)。
 

圖 1 分選后HeLa細胞的生長曲線。（照片拍攝于第三天）

利用On-chip Sort 無損傷流式細胞分選儀分選的細胞在分選后第二天開始生長，并且在第三天細胞數(shù)量翻倍增長。另一方面，利用傳統(tǒng)細胞分選儀分選的細胞在分選后第三天才開始生長，與On-chip Sort 無損傷流式細胞分選儀相比，分選后的細胞生長較慢。
 

02.  分選對細胞形態(tài)的影響
比較傳統(tǒng)的細胞分選儀和On-chip Sort 無損傷流式細胞分選儀對極易受到物理損傷的嗜酸性粒細胞在分選后的形態(tài)的影響。
 

圖 2 用蘇木精和伊紅染色的外周血嗜酸性粒細胞的形態(tài)學圖。分別利用On-chip Sort 無損傷流式細胞分選儀（左）和傳統(tǒng)細胞分選儀（右）分選后通過細胞涂片進行固定。

明顯觀察到分選后細胞形態(tài)上的變化。利用On-chip Sort 無損傷流式細胞分選儀分選后的嗜酸性粒細胞基本完好無損，細胞結(jié)構(gòu)保持不變。但是，利用傳統(tǒng)細胞分選儀分選后的細胞出現(xiàn)破碎的情況。據(jù)推測，傳統(tǒng)的細胞分選儀在分選時可能會導致細胞膜受損，所以分選后出現(xiàn)細胞破碎。

03.  分選對基因表達的影響
許多研究人員在分析基因表達之前將細胞分為多個亞群體。為了檢測傳統(tǒng)細胞分選儀和On-chip Sort 無損傷流式細胞分選儀的細胞分選對基因表達模式差異的影響，于是，在兩種細胞分選儀上對50000個Caco-2細胞和HeLa細胞進行分選。通過使用未分選細胞作為對照的微陣列分析來確定每種細胞類型的基因表達水平變化。
 

圖 3 比較利用On-chip Sort 無損傷流式細胞分選儀（3a）和傳統(tǒng)細胞分選儀A（3b）分選后的HeLa細胞和未分選的HeLa細胞的基因表達水平變化。紅點代表上調(diào)基因，綠點代表下調(diào)基因。百分比數(shù)字表示所有基因上調(diào)（紅色）和下調(diào)（綠色）的百分比。（3c）表示通過On-chip Sort 無損傷流式細胞分選儀和傳統(tǒng)細胞分選儀A分選后Caco-2細胞和HeLa細胞未受影響的基因表達的直方圖。百分比數(shù)字表示所有分類特性（細胞凋亡、細胞黏附、細胞周期等）的未受影響基因占總基因的比例。表達變化的比率被定義為分選細胞的信號強度/未分化細胞的信號強度。
 

圖 4 具有已確認差異的分類特性的基因表達模式。在每個屬性中，左列和右列分別表示On-chip Sort 無損傷流式細胞分選儀和傳統(tǒng)細胞分選儀的數(shù)據(jù)。黑色表示基因表達沒有變化，紅色表示上調(diào)，綠色表示下調(diào)。

圖3a、3b和3c顯示，與傳統(tǒng)細胞分選儀相比，On-chip Sort 無損傷流式細胞分選儀對HeLa細胞分選后基因表達變化較小。并且，基因表達水平上沒有變化的基因數(shù)量比傳統(tǒng)細胞分選儀高3-5倍。圖4顯示的兩種細胞分選儀之間基因表達模式的各種差異支持了圖1表示的兩種細胞分選儀對細胞生長速率影響的差異這一結(jié)果。盡管基因表達分析是在兩種類型的細胞分選后30到60分鐘內(nèi)完成的，但是根據(jù)分選后的進程不同，結(jié)果可能有所不同，總的來說，可以觀察到傳統(tǒng)細胞分選儀和On-chip Sort 無損傷流式細胞分選儀分選后基因表達的差異。

04.  分選神經(jīng)元
近年來，與疼痛相關的神經(jīng)活動的研究以及疼痛可視化的研究已經(jīng)發(fā)展到了各個領域。在背根神經(jīng)節(jié)（DRG）中發(fā)現(xiàn)的一種稱為DRG神經(jīng)元的感覺神經(jīng)元（傳入神經(jīng)元）的細胞體負責來自外界和器官之間的疼痛傳遞。然而，DRG中存在許多其他類型的細胞，因此它們由異質(zhì)細胞群組成。由于DRG中存在多種DRG神經(jīng)元類型，細胞對疼痛的反應是不同的。因此，從異質(zhì)樣本中分離出一種特定類型的DRG神經(jīng)元可以讓研究人員更好地了解其生物化學和神經(jīng)傳遞的電信號，還可以有利于藥物開發(fā)。
 

圖 5 散點圖（5a）顯示了利用On-chip Sort 無損傷流式細胞分選儀根據(jù)大小從異質(zhì)DRGs細胞樣本中分選的兩個單獨細胞群（用紅色箭頭表示，命名為“大”和“小”）的閥門。通過抗-β-微管蛋白III（綠色）和抗突觸素（紅色）染色，確定（5a）中分離的“大”（5b）和“小”（5c）細胞群中的神經(jīng)細胞。

從10周齡大鼠收集的DRG細胞通過酶處理分離，并在分選前懸浮在神經(jīng)細胞基礎培養(yǎng)基中。根據(jù)大小對預處理樣品進行分類。從大小分布中觀察到四組細胞，其中兩組細胞利用On-chip Sort 無損傷流式細胞分選儀分選并培養(yǎng)五天。這兩個細胞群都被多聚甲醛固定，并用抗-β-微管蛋白III和抗突觸素染色，其中，抗-β-微管蛋白III可以識別神經(jīng)元中的微管蛋白，抗突觸素可以識別負責神經(jīng)傳遞的神經(jīng)元。染色結(jié)果證實這兩個細胞群都是DRG中的活性神經(jīng)細胞。因此，這些結(jié)果表明，On-chip Sort 無損傷流式細胞分選儀能夠按大小分離DRG神經(jīng)元，同時保持細胞活性。

05.  分選誘導性多能干細胞
在再生醫(yī)學領域，來自胚胎干細胞或誘導性多能干細胞（iPSC）的分化體細胞被移植給患者。然而，任何剩余的未分化細胞一旦被植入就會變成腫瘤，阻礙患者治療的進展。因此需要在移植前有效去除未分化的細胞。On-chip Sort 無損傷流式細胞分選儀通過一種稱為“多步驟負分選”的方法，可以有效地去除樣品中少有存在的未分化細胞。

圖 6 （6a）多步驟負分選原理。紅點是未分化的細胞，藍點是分化的細胞。（6b）通過多步驟負分選從分化的神經(jīng)干細胞樣品中去除未分化的細胞。

On-chip Sort 無損傷流式細胞分選儀上的多步驟負分選通過加載樣品（與少有的未分化細胞群混合的分化細胞）到芯片的樣品池中。未分化的細胞（非靶細胞）通過脈沖流的形成而被去除，流入收集池，而分化的細胞（靶細胞）則流入芯片下游的廢液池。分化的細胞被回收并重新加載到樣品池中進行進一步純化。重復這個過程直到所有未分化的細胞被去除。圖6b顯示了含有分化為神經(jīng)干細胞的細胞的樣品中約4%的未分化細胞被去除。用FITC偶聯(lián)的抗-TRA-1-60熒光標記未分化細胞，熒光信號用于檢測。所有未分化的細胞在三次分選后全部被去除，并且分選的分化細胞在培養(yǎng)后表現(xiàn)出良好的細胞活性。

06.  分選細胞-細胞混合物
On-chip Sort 無損傷流式細胞分選儀可以分離出通過弱鍵連接的細胞，甚至那些很容易被移液管分離吸取的細胞。圖7顯示了從異質(zhì)細胞混合物中分離出通過弱細胞間相互作用而結(jié)合在一起的細胞雙復合體（綠色和紅色細胞）。
 

圖 7 （7a）異質(zhì)樣品中通過若細胞間相互作用結(jié)合在一起的細胞雙復合體（綠色和紅色細胞）的分類。（7b）通過On-chip Sort 無損傷流式細胞分選儀分選前（左）和分選后（右）的樣品。