圖 1C，使用ibidi 泵系統(tǒng)灌注培養(yǎng) 14 天后，L929 球體在 µ-Slide 球體灌注、Bioinert中的活/死 FDA/PI 染色，0.75 毫升/分鐘。綠色：活細(xì)胞（熒光素二乙酸酯，F(xiàn)DA）；紅色：死細(xì)胞（碘化丙錠，PI）。寬場熒光顯微鏡，10 倍物鏡。

在建立細(xì)胞培養(yǎng)模型以研究細(xì)胞功能、特定疾�。ɡ�如癌癥）或表征某些藥物之前，研究人員必須考慮這些因素。為了獲得最接近體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，盡可能接近地模擬活體組織的生理?xiàng)l件也是有意義的。

在這篇文章中，我們介紹了不同的 3D 細(xì)胞培養(yǎng)模型來研究類似體內(nèi)狀態(tài)的細(xì)胞。

從單層細(xì)胞到組織：

雖然細(xì)胞仍然主要在經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)處理的塑料表面或涂有蛋白質(zhì)或厚細(xì)胞基質(zhì)（2.5D 培養(yǎng)）的 2D 單層細(xì)胞中培養(yǎng)，但如果您有興趣在更廣泛的環(huán)境中培養(yǎng)細(xì)胞，則可以從各種 3D 細(xì)胞培養(yǎng)模型中進(jìn)行選擇生理方式（圖2）。

可以使用基于支架的技術(shù)，例如聚合物或水凝膠，它們通過合成化學(xué)聚合物或蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)提供結(jié)構(gòu)支持。或者，可以使用無支架技術(shù)獲得3D細(xì)胞結(jié)構(gòu)，其中可以在沒有額外結(jié)構(gòu)支持的情況下形成復(fù)雜的細(xì)胞聚集體或整個組織。
 

圖 2：2D 和 3D 細(xì)胞培養(yǎng)模型概述。

在決定哪種技術(shù)最適合各自的研究問題時，應(yīng)考慮這兩種方法的優(yōu)缺點(diǎn)。支架方法考慮了細(xì)胞與 ECM 的相互作用，而細(xì)胞的環(huán)境可以用懸浮生長的球體更好地操縱。為了在顯微鏡上長期培養(yǎng)和研究 3D 結(jié)構(gòu)，已經(jīng)開發(fā)了特殊的工具和技術(shù)，以確保在較長時間內(nèi)持續(xù)提供培養(yǎng)基和模擬生理?xiàng)l件。

基于支架的 3D 細(xì)胞培養(yǎng)模型：

3D 細(xì)胞培養(yǎng)模型的支架范圍從多孔聚合物膜到模擬 ECM 細(xì)胞微環(huán)境的復(fù)雜水凝膠。

一般來說，水凝膠形成交聯(lián)聚合物的結(jié)構(gòu)，可以吸收和結(jié)合大量的水。在 4°C 或室溫下，混合物是液體，但在 37°C 下會形成凝膠。此功能使得可以將液體與細(xì)胞混合，然后在 37° 下孵育時將細(xì)胞嵌入三維矩陣中。這允許細(xì)胞保留特定的體內(nèi)特征,例如細(xì)胞-ECM 相互作用或環(huán)境的生理和機(jī)械特性。

有不同類型的水凝膠，例如 Matrigel ®或 膠原蛋白，它們來自有機(jī)來源。然后，復(fù)雜的合成水凝膠具有精確控制其成分（分子、交聯(lián)劑等）的優(yōu)勢。這允許對各個組件的影響得出不同的結(jié)論。

無支架 3D 細(xì)胞培養(yǎng)模型：

獨(dú)立于支架的方法允許在沒有矩陣支持的情況下以 3D 方式培養(yǎng)細(xì)胞。它們依賴于細(xì)胞自組裝成聚集體或球狀體的概率。建立了多種技術(shù)來促進(jìn)這種自組裝過程。

圖 3：在µ-Slide 4 Well中培養(yǎng)的纖維蛋白水凝膠中發(fā)芽的人腸成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞球體。內(nèi)皮細(xì)胞用 CD31（黃色）染色，成纖維細(xì)胞用波形蛋白（紅色）染色，DNA 用 DAPI（青色）染色。共聚焦圖像由 H. Nogueira Pinto 拍攝，生物工程 3D 微環(huán)境小組，Instituto de Investigação e Inovação em Saúde (i3S)，Universidade do Porto，葡萄牙。

懸滴技術(shù)

懸滴技術(shù)是生物學(xué)中行之有效的方法，已用于許多不同的應(yīng)用，例如整個（微生物）生物體的觀察或蛋白質(zhì)的結(jié)晶。它利用重力形成從玻璃板上垂下的懸浮液滴。

在過去的十年中，這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)過修改并適用于3D細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用，允許從細(xì)胞懸液中形成球狀體而無需支撐支架（圖 4）。如今，專門的懸滴板已在市場上銷售。然而，雖然這種方法適用于球體的生成，但不可能將其與高分辨率顯微鏡相結(jié)合。
 

圖 4：懸滴法原理。

超低吸附 (ULA) 涂層

所謂的低粘附板涂有中性電荷或親水性蛋白質(zhì)或水凝膠，可減少細(xì)胞對板表面的附著，從而形成 3D 細(xì)胞結(jié)構(gòu)。雖然這種涂層主要防止細(xì)胞附著，但在更長的時間后細(xì)胞粘附仍然會發(fā)生，因?yàn)橥繉油ǔＶ皇俏锢砦�附而不是共價結(jié)合——因此不是長期穩(wěn)定的。

生物惰性表面

與標(biāo)準(zhǔn) ULA 涂層相比，生物惰性表面共價結(jié)合并提供穩(wěn)定的表面鈍化。因此，它可以完全防止蛋白質(zhì)或細(xì)胞附著到涂層表面。這促進(jìn)了細(xì)胞間的相互作用和 3D 細(xì)胞聚集體的形成，即使在長期實(shí)驗(yàn)中也是如此（圖 5）。
 

圖 5：ibidi 聚合物蓋玻片上生物惰性表面上的球體形成。

微圖案表面微孔板

 在 Bioinert 表面上壓印微圖案可以使細(xì)胞精確粘附在指定位置（圖 6）。µ 圖案斑點(diǎn)周圍的鈍化區(qū)域有助于形成 3D 細(xì)胞聚集體和球狀體（圖 7 和 8）。

圖 6：微圖案斑點(diǎn)上細(xì)胞附著的動圖。



圖 7：微圖案點(diǎn)上球體形成的原理。