腺相關(guān)病毒（AAVs）已被批準用于基因治療——將遺傳物質(zhì)輸送到靶組織。制備AAV介導(dǎo)的基因療法的一個挑戰(zhàn)是質(zhì)量控制，尤其是空殼與負載（全衣殼）的比例。在這里，我們展示了如何在AAV血清型中使用質(zhì)量光度計，以可靠且可重復(fù)地測量AAV樣品純度和空殼/負載比率。這些測量可以在幾分鐘內(nèi)用少量樣品進行。

目前正在尋求以AAVs為運載工具的基因療法，以治療帕金森氏癥、遺傳性失明、脊髓肌萎縮和血友病等疾病，取得了有希望的結(jié)果和良好的安全性。盡管在純化過程中取得了進展，但由于缺乏快速可靠的方法來評估AAV的完整性、成功包裝的遺傳物質(zhì)的數(shù)量以及宿主細胞和輔助病毒中蛋白質(zhì)和核酸污染物的存在，AAV的生產(chǎn)受到阻礙。有缺陷或空的AAV是不受歡迎的，因為它們可以在治療過程中競爭細胞受體，降低治療效果，并導(dǎo)致意外的免疫反應(yīng)。。

質(zhì)量光度計適用于AAV分析

質(zhì)量光度計測量單個粒子的質(zhì)量，該測量既不受粒子大小也不受其形狀的影響。由于AAV衣殼在負載時質(zhì)量增加，但其大小和形狀不變，因此質(zhì)量光度計是量化AAV裝載的理想方法（圖1）�？蛰d的和負載的AAV之間的差異可以使用質(zhì)量光度計清楚地解決（圖5）。質(zhì)量光度計還可以檢測AAV樣品中的污染物，其質(zhì)量往往較低（圖1）。

在用于量化AAV空殼/負載比率的替代方法中，最常見的是分析超速離心和透射電鏡。然而，這些方法在技術(shù)上具有挑戰(zhàn)性，涉及大量的樣品工作，并且在成本以及分析所需的時間和樣品量方面都很昂貴2。相比之下，質(zhì)量光度計快速（測量一個樣品大約需要一分鐘），只需要很少的樣品。在本應(yīng)用說明中，我們演示了如何使用質(zhì)量光度計來量化AAV負載和檢測雜質(zhì)。

質(zhì)量光度計測定準確無誤

首先，我們選擇了一個模型，用質(zhì)量光度計測量了空AAV5衣殼樣品的質(zhì)量分布。我們通過對同一樣本進行六次獨立測量來評估準確度，得出了高度一致的結(jié)果（Rg.2）。在每次質(zhì)量光度計測量中，主峰對應(yīng)于空殼，而較低質(zhì)量的信號則表明存在污染物。AAV5衣殼分子質(zhì)量的平均值和標準偏差為3.69+/-0.10 MDa。由于這些衣殼的預(yù)期分子質(zhì)量為3.7 MDa，因此該結(jié)果具有極好的質(zhì)量精度（2.7%）和高精度。

AAV血清型的質(zhì)量光度計測定工作

AAV存在于許多亞單位組成和序列不同的血清型中。這些血清型特異性影響其免疫原性、向性和受體結(jié)合。因此，針對不同組織時，AAV血清型的選擇很重要。除了自然出現(xiàn)的血清型外，還開發(fā)了合成血清型。一種人工合成的AAV-DJ結(jié)合了八種不同野生型病毒的序列，導(dǎo)致免疫原性降低；在體內(nèi)，它以肝臟為靶點。

為了測試質(zhì)量光度計是否適用于AAV血清型，我們測量了包含四種不同血清型（AAV5、AAV6、AAV8和AAVDJ）的空衣殼的樣本。在每種情況下，都觀察到一個單一的對稱峰，大約3.7 MDa。獲得的結(jié)果清楚地表明，質(zhì)量光度計在血清型中產(chǎn)生一致的結(jié)果（圖3）。

量化AAV空殼/負載比率

在描述AAV特征時，最重要的參數(shù)之一是空殼/負載比率，它反映了包含感興趣基因組拷貝的衣殼的比例。為了探索如何使用質(zhì)量光度計測量該參數(shù)，我們制備了含有不同數(shù)量的商用空和滿AAV8衣殼制劑的混合物。然后，我們使用質(zhì)量光度計測量每個混合物中滿載衣殼的百分比（圖4）。測得的百分比與預(yù)期值非常匹配（根據(jù)每種混合物中全衣殼制劑和空衣殼制劑的比例以及制造商關(guān)于每種制劑的信息計算得出）。混合物的預(yù)測負荷為空：0%；混合物1:32%；混合物2:48%；混合物3:63%；混合物4:95%。

含有空殼/負載AAV的混合物的質(zhì)量分布有兩個峰值（圖4）。3.7 MDa左右的峰值對應(yīng)于空衣殼，而較高質(zhì)量的峰值對應(yīng)于全衣殼。通過對峰值之間的對比度差進行DNA校準，可以確定全衣殼中DNA負載的質(zhì)量（見下文）。

這些結(jié)果表明，質(zhì)量光度計始終能夠獲得AAV制劑的負載百分比（或空殼/負載比率）的可重復(fù)和可靠測量值。

確定AAV裝載物的質(zhì)量

除了測量空殼/負載比率和識別污染物外，質(zhì)量光度計還可用于量化AAV衣殼基因組裝載物的質(zhì)量。為了測量裝載物的質(zhì)量，我們假設(shè)兩個峰值（空殼和負載）之間的質(zhì)量光度計測定信號的差異是由于該裝載物的存在。為了將這種差異轉(zhuǎn)化為裝載物的質(zhì)量，我們在質(zhì)量光度計計上對DNA進行了特定校準，因為DNA的折射率不同于蛋白質(zhì)的折射率。總的來說，對重組蛋白的三組測量表明，使用質(zhì)量光度計在單個分子水平上監(jiān)測樣本中的所有蛋白質(zhì)物種，可以對難以分析的多步驟反應(yīng)提供有價值的見解。

在AAV5衣殼的測量中，我們發(fā)現(xiàn)兩個峰值之間AAV衣殼質(zhì)量的平均差異對應(yīng)于1.5+/-0.1 MDa的核酸量（圖5），這非常接近4.8 kb基因組預(yù)測的1.6 MDa。

總結(jié)

質(zhì)量光度計為評估AAV樣品的質(zhì)量提供了重要信息。通過使用質(zhì)量光度計測量AAV樣品中顆粒的質(zhì)量分布，可以量化空/滿AAV衣殼比，檢測污染物并測量AAV裝載物的質(zhì)量。這些測量只需幾分鐘，使用很少的樣品（這里使用20μL稀釋至每毫升1x1011個顆粒的樣品），并且只需要基本的實驗室技能�？偟膩碚f，質(zhì)量光度計可以作為一種快速可靠的AAV質(zhì)量控制方法。

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