siRNA小干擾RNA轉染實驗操作流程介紹及要點
siRNA（小干擾RNA）是一種新型的基因治療工具，是由21-25個核苷酸組成的雙鏈短RNA分子，能夠特異性地誘導靶基因的沉默，進而抑制蛋白的表達。siRNA最初由Andrew Fire和Craig Melo在1998年提出，之后在2001年被證明可以特異性地抑制哺乳動物細胞中的靶基因表達。這一發(fā)現(xiàn)由David Baulcombe團隊在《科學》雜志上發(fā)表，成為當年全球十大科學進展之首，他的團隊并于2006年榮膺了諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。
siRNA的抑制作用是通過其與AGO蛋白組裝成的RNA誘導沉默復合體（RISC）發(fā)揮的。一條鏈被降解，另一條鏈則與靶基因的mRNA互補配對，使其被切割降解，從而達到治療相關疾病的目的。與傳統(tǒng)的基因治療相比，siRNA具有高度特異性、快速、可逆性等優(yōu)點，可以應用于各種真核生物的基因功能研究，藥靶發(fā)現(xiàn)及藥物篩選中廣泛應用。例如siRNA靶向惡性腫瘤的基因可以通過局部或系統(tǒng)性給藥來治療腫瘤，病毒感染和遺傳疾病也都有涉及。
siRNA 抑制蛋白表達機制
為了方便使用，常規(guī)siRNA產品以凍干粉形式提供，可以直接用于各種細胞RNAi實驗�？蒲腥藛T可以根據(jù)需要設計特定靶點，覆蓋人、小鼠、大鼠全基因組的所有基因。同時，通過對siRNA進行化學修飾，可以提高其在體內實驗中的高效性、特異性和穩(wěn)定性。
RNA干擾（RNAi）是一種廣泛存在于生物體內的序列特異性基因轉錄后的沉默過程，常常被用作基因沉默（基因干擾）的工具之一。siRNA作為RNAi的一種形式，具有非常廣闊的應用前景。未來，siRNA還將繼續(xù)發(fā)揮其獨特的優(yōu)勢，成為治療相關疾病的新趨勢。
siRNA轉染實驗介紹
01- siRNA儲存
常規(guī)化學合成的siRNA序列為21～23nt的雙鏈小分子RNA，為凍干粉形式的即用型試劑 ，在常溫不溶解的情況下可以保存至少1個月時間，放置于-20℃～-80℃低溫環(huán)境中，凍干粉可以穩(wěn)定保存一年。
02- 轉染試劑儲存
4℃保存，不可冷凍。
03-體外轉染操作流程：
第一步、接種細胞：建議提前一天接種細胞，接種數(shù)量參考下方推薦量。
第二步、 轉染復合液配制：
● siRNA稀釋液配制：siRNA以水稀釋至140 μg/mL。
● siRNA轉染復合液配制：取無菌離心管，加入2μL siRNA稀釋液，加入LipidnanoTM Super RNAi轉染試劑A液14μL，吹打混勻，加入LipidnanoTM Super RNAi轉染試劑B液4μL，混合均勻，室溫放置5min，加培養(yǎng)液180μL，吹打混勻。
第三步、細胞加樣：按下方推薦量將配制好的siRNA轉染復合液加入各細胞孔中，搖動培養(yǎng)板，輕輕混勻。
第四步、細胞培養(yǎng)：37 ℃，5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)，直至發(fā)揮干擾作用。建議24~48h測定mRNA水平、48~72h測定蛋白水平。
操作流程示例
siRNA樣品加入示例
注：使用本轉染試劑對細胞進行siRNA轉染時，為了獲得最佳基因沉默效果，每一種細胞系轉染siRNA的劑量都需要經(jīng)過實驗確定最佳范圍。
示例中使用的體外轉染試劑為同立海源生產的LipidnanoTM Super RNAi轉染試劑，主要應用于：貼壁細胞和懸浮細胞轉染，部分原代細胞和轉化細胞株的基因轉染，siRNA高通量轉染試驗。在進行體外轉染實驗的過程中，實驗還需注意這些細節(jié)：
❶ 轉染前，確保siRNA是經(jīng)過PAGE純化和脫鹽處理過的，高純度的siRNA或者miRNA有助于獲得較高的轉染效率，并確保 siRNA/miRNA 基因沉默表達不會影響細胞活力。
❷ 首次轉染：如果您是首次轉染您的細胞系，推薦嘗試使用幾個siRNA轉染試劑復合液濃度，并在0.014μg/mL~0.70μg/mL范圍內改變siRNA的濃度，根據(jù)首次轉染結果調整劑量水平。
❸ siRNA轉染試劑稀釋液的選擇：對培養(yǎng)基無特殊要求，可使用完全培養(yǎng)基進行稀釋，不強要求減/無血清培養(yǎng)基。
❹ 濃度換算：摩爾濃度與質量濃度之間的換算關系可根據(jù)siRNA分子量可進行同步換算。X nmol/L*分子量=Y ng/L，如分子量為14000的siRNA，1nmol/L*14000=14000ng/L=14μg/L。
❺ 轉染細胞密度：推薦在70％左右時進行轉染。通�；虺聊姆治鲆谵D染后24小時進行。本轉染試劑極低的細胞毒性可以方便研究者根據(jù)目的細胞生長特性，靶基因的表達特性，選擇適合條件進行轉染。健康的細胞培養(yǎng)物和嚴格的操作確保轉染的重復性。通常健康的細胞轉染效率較高，較低的傳代數(shù)能確保每次實驗所用細胞的穩(wěn)定性。推薦用50代以下的細胞轉染。
❻ 陽性對照選擇：通過合適的陽性對照、實驗siRNA優(yōu)化轉染和檢測條件，對大多數(shù)細胞，GADPH-siRNA是較好的陽性對照。將不同濃度的陽性對照siRNA或實驗siRNA轉入靶細胞，轉染24小時后，以內參基因如β-actin mRNA為對照，統(tǒng)計目標mRNA相對于未轉染細胞的降低水平。
傳統(tǒng)轉染試劑可通過表面正電荷幫助siRNA大量攝取入胞，但入胞后siRNA內含體逃逸水平低，造成攝取的siRNA無法發(fā)揮作用，同時造成細胞毒性。本品為非強正電性脂質轉染試劑，避免細胞大量攝取造成的毒性，但本品可提升細胞內吞后的siRNA內含體逃逸效率，通過促進內含體逃逸使更多siRNA釋放入細胞質中實現(xiàn)高效基因沉默作用。故在細胞水平上通過熒光標記siRNA進行條件優(yōu)化的方法不適用于本轉染試劑。推薦使用Western Blot或QPCR方式對最佳轉染濃度進行優(yōu)化。
❼ 操作注意：siRNA與轉染試劑A液實現(xiàn)充分混合后加入B液，繼續(xù)混合均勻，放置5min后加入培養(yǎng)基稀釋，稀釋后需在1h內加入細胞孔內。將siRNA轉染試劑復合液加至每一個包含細胞和培養(yǎng)基的孔中，加入后可以輕輕地前后搖動培養(yǎng)板混合均勻。
❽ 避免RNA酶污染：微量RNA酶會導致siRNA實驗失敗。由于實驗環(huán)境中RNA酶普遍存在，如皮膚、頭發(fā)、所有徒手接觸過的物品或暴露在空氣中的物品。因此請確保實驗每個步驟不受RNA酶污染。推薦使用商業(yè)化無酶實驗耗材。
❾ 效果評價：細胞轉染后，不同細胞和siRNA效率存在差異。在mRNA水平觀察siRNA效果的最佳時間是轉染后24~48小時，在蛋白水平觀察siRNA效果的最佳時間是轉染后48~72小時。siRNA干擾是非線性的，不同基因半衰期存在較大差異，首次進行siRNA干擾效果測定時，建議多點測定，確定最佳測定時間點。
siRNA沉默效果分析
siRNA 轉染細胞后，siRNA 在細胞內一系列酶的作用下形成RNA誘導的沉默復合物(RISC)，識別并切割靶基因mRNA，誘發(fā)宿主細胞針對這些mRNA的降解反應， 從而抑制了細胞內目的基因蛋白的表達，一般可從兩個方面進行檢測。mRNA 水平 - qPCR檢測：
siRNA的作用機理在于其引起靶基因mRNA的降解，因此mRNA的降解水平是siRNA 沉默效率的直接證明。一般在siRNA轉染后24小時后即可檢測到靶mRNA水平的降低，可采用細胞總RNA提取，全長cDNA合成，熒光定量實驗即可檢測到mRNA 的敲除效率。
蛋白水平 - WB檢測：
siRNA引起靶基因mRNA的降解，從而影響了靶蛋白的表達。但蛋白水平檢測時間受細胞內目的蛋白表達量、穩(wěn)定性、半衰期、甚至其他調控等因素的影響，蛋白質水平下降的幅度與mRNA水平下降不一定成線性正比關系。一般在轉染后48小時后開始WB檢測，并于72小時、96 小時甚至更長時間之后多點采樣。
小結：RNA轉染過程中的影響因素比較多，主要可以歸納為轉染方法、轉染試劑和轉染細胞等三個方面。除此之外，RNA的結構、RNA轉染時RNA的用量、RNase的污染、進入細胞后RNA的降解等因素也會使RNA轉染過程更加復雜、給轉染結果帶來影響，其中RNA在轉入細胞后的降解問題在RNA轉染過程中是比較重要的，如果轉染的RNA在進入細胞體后大量降解，那么實驗結果就很不準確了。
說明：本文僅用于傳播知識、普及科學，不構成任何醫(yī)療建議，如有版權等問題，請隨時聯(lián)系我們。
