第1步：

 

必須在預(yù)實(shí)驗(yàn)中確定細(xì)胞系的正確接種濃度。根據(jù)您的細(xì)胞類型，用4-6x10 4細(xì)胞/ ml在2-3天內(nèi)產(chǎn)生匯合的單層。

1.打開(kāi)孔可移除腔室載玻片（ibidi，80841）包裝，在無(wú)菌條件下。

2.像往常一樣用胰蛋白酶消化并計(jì)數(shù)細(xì)胞。細(xì)胞濃度為5×104細(xì)胞/ ml MCF-7。

3. 將400微升細(xì)胞懸浮液加入腔室的每個(gè)孔中。避免搖晃，因?yàn)檫@會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞分布不均勻。

4. 用配套的蓋子蓋住。在37°C和5％CO2下培養(yǎng)。細(xì)胞至少培養(yǎng)24小時(shí)，或直到建立融合的單層。

第2步：

 

固定是染色程序的第一步。目標(biāo)是將細(xì)胞，細(xì)胞形成物或組織維持在其當(dāng)前狀態(tài)，并在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)通過(guò)化學(xué)試劑保存。

1.小心地吸出細(xì)胞培養(yǎng)基。

2.用PBS洗兩次。

3.加入400μl福爾馬林溶液。

4.在室溫下孵育30分鐘。

5.小心吸入福爾馬林溶液。

6.用PBS洗滌三次。

第3步：

 

應(yīng)根據(jù)感興趣的細(xì)胞結(jié)構(gòu)選擇染色試劑。在該方案中使用DAPI和DYE-490鬼筆環(huán)肽染色MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞核和肌動(dòng)蛋白骨架。

1.準(zhǔn)備你的染色溶液：

· 聚苯硫醚

· DYE-490鬼筆環(huán)肽

· DAPI 1µg/ml

2.小心吸出PBS。

3.移取400μl染色溶液到每個(gè)孔中

4.在室溫下避光孵育30分鐘

第4步：

  

在染色后清洗你的樣本會(huì)使背景信號(hào)降到最低   

1.小心地吸出染色溶液   

2.加入400μl緩沖液     

3.小心吸入緩沖液   

4.重復(fù)步驟2和步驟3一次

第5步：

從一個(gè)邊部開(kāi)始，用手或用鑷子小心地取下硅膠墊圈。該步驟應(yīng)以緩慢，穩(wěn)定的進(jìn)行，以避免損壞細(xì)胞層。

第6步：

完成染色程序后，必須在用顯微鏡成像之前封固樣品。該步驟還防止樣品脫水。

1.將載玻片側(cè)面在干凈的實(shí)驗(yàn)室濕巾上輕敲，從樣品中去除多余的介質(zhì)。

2.將封固劑涂在樣品上。用24毫米x 60毫米的蓋玻片覆蓋安裝的樣品，小心地將蓋玻片放到安裝介質(zhì)上，以避免夾住任何氣泡。

第7步：顯微觀察

在可移除 8 孔腔室中免疫染色的 MCF-7 細(xì)胞的熒光顯微鏡檢查。綠色：α-微管蛋白，紅色：F-肌動(dòng)蛋白（鬼筆環(huán)肽），藍(lán)色：細(xì)胞核 (DAPI)。寬場(chǎng)熒光圖像是用 20 倍物鏡拍攝的。

免疫熒光實(shí)驗(yàn)實(shí)例

人眼的小梁網(wǎng)細(xì)胞，在 ibidi 8 Well Chamber 上培養(yǎng)，可移除。F-肌動(dòng)蛋白絲顯示為綠色；細(xì)胞核被 DAPI（藍(lán)色）染色。圖片由中國(guó)香港香港理工大學(xué)視光學(xué)院的 Samantha Shan 提供。

 

 

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