胰島具有復(fù)雜的異質(zhì)性和亞種群，包含異質(zhì)性細胞、未成熟和成熟的亞群。由于胰島素是血糖的主要調(diào)節(jié)器，大多數(shù)關(guān)于胰島功能障礙的研究都局限于β細胞。然而，越來越多的證據(jù)強調(diào)了α、β和δ細胞在葡萄糖穩(wěn)態(tài)中的協(xié)同相互作用^[1-3]。高脂肪飲食（HFD）是導(dǎo)致2型糖尿病的一種常見原因，它會導(dǎo)致胰島的代償性適應(yīng)，隨著胰島功能損傷加劇，會使得病人的癥狀加重^[4-6]。目前迫切需要α、β和δ細胞亞群的細胞表面標(biāo)志物，以探索肥胖進展和糖尿病發(fā)病過程中各亞群的組成變化，以及高脂飲食誘導(dǎo)胰島代謝的適應(yīng)機制。

 

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科楊濤教授團隊在Diabetologia（IF=10.12）上發(fā)表了題為“Single-cell RNA sequencing combined with single-cell proteomics identifies the metabolic adaptation of islet cell subpopulations to high-fat diet in mice”的文章（點擊文末“閱讀原文”查看文獻）。

 

該研究采用單細胞RNA測序（scRNA-seq）結(jié)合單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析，深入闡明了各α、β、δ細胞亞群在葡萄糖耐受不良中的功能狀態(tài)，為探索胰島內(nèi)分泌亞群在健康和疾病中的命運和功能機制提供了基礎(chǔ)資源。

 

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院付麒、蔣和敏、錢玙為本文共同第一作者，楊濤、徐寬楓研究員為共同通訊作者，華大科技質(zhì)譜平臺為該研究提供了單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析服務(wù)。

 

 

 

研究思路及主要成果

 

圖1 研究流程圖

 

1、小鼠胰島細胞scRNA-seq

該研究將4周大的雄性小鼠隨機分成兩組，正常喂養(yǎng)（CD）組和高脂肪飲食（HFD）組，喂養(yǎng)8周，每周監(jiān)測體重。8周的HFD誘導(dǎo)小鼠明顯肥胖，葡萄糖穩(wěn)態(tài)受損，并誘導(dǎo)胰島素抵抗，HFD導(dǎo)致胰島團塊代償性增生，尤其是β細胞。研究人員利用高通量scRNA-seq分析了15,093個來自CD小鼠胰島的細胞和18,906個來自HFD喂養(yǎng)小鼠胰島的細胞，并聚成四種主要內(nèi)分泌細胞，基于主要激素基因表達進行了注釋：4,069個α（Gcg）、14,108個β（Ins1）、1,698個δ（Sst）和666個PP（Ppy）細胞。

 

從HFD組與CD組比較的α、β、δ細胞的差異表達基因（DEGs）來看，α、β、δ細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工明顯富集，炎癥相關(guān)通路在α細胞中特別豐富（圖2a），這表明炎癥反應(yīng)對HFD誘導(dǎo)的代謝應(yīng)激的重要性。在β細胞中，鈣轉(zhuǎn)運和離子通道調(diào)節(jié)途徑排在首位（圖2b），表明其與分泌功能相關(guān)。此外，在β和δ細胞中，氧化呼吸鏈、能量產(chǎn)生和代謝途徑都顯著富集。在δ細胞中，其他顯著受HFD影響的途徑是蛋白質(zhì)降解和循環(huán)相關(guān)途徑（圖2c）。

 

圖2 HFD和正常組之間α（a）、β（b）和δ（c）細胞中DEGs富集的KEGG通路前20位

 

 

2、胰島細胞亞群的單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析

由于mRNA的表達不能完全反映細胞或器官的生物活性，全面的蛋白表達譜在胰島細胞亞群研究中是必不可少的。然而，傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)需要樣本量高，而小鼠胰腺中胰島細胞數(shù)量有限，流式細胞儀分類的細胞亞群產(chǎn)量低。

 

因此，該研究對胰島細胞亞群進行了單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析。首先，研究人員利用大量胰島樣品的譜庫，在數(shù)據(jù)依賴采集模式下進行質(zhì)譜（MS）數(shù)據(jù)采集，鑒定出90,494個多肽和8,168個蛋白質(zhì)。接下來，MaxQuant集成的Andromeda引擎識別了α、β和δ亞群的單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)樣本中的蛋白質(zhì)。最終，在36個胰島細胞亞群樣本（2種飼料×3種內(nèi)分泌細胞類型×2種細胞亞群×3個重復(fù)）中，研究人員鑒定出6,955個蛋白質(zhì)和50,245個肽。

圖3 單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析示意圖

圖4 胰島細胞亞群間差異蛋白表達熱圖和富集KEGG通路

 

 

3、RNA測序技術(shù)結(jié)合單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)闡明各細胞亞群在葡萄糖耐受不良中的功能狀態(tài)

 

ACE2^low α細胞可能代表低容量、脆弱和對HFD應(yīng)激易感性的狀態(tài)

為了探索ACE2為基礎(chǔ)的α細胞異質(zhì)性的分子特征，在Ace2^low和Ace2^high亞群之間鑒定出379個DEGs，KEGG分析顯示，DEGs優(yōu)先富集于氧化磷酸化、代謝途徑、α細胞分泌功能相關(guān)途徑和程序性細胞死亡、增殖途徑，表明Ace2表達可以區(qū)分不同功能和生存狀態(tài)的α細胞。與Ace2^high亞群相比，Ace2^low亞群與α細胞功能相關(guān)的基因表達下調(diào)，與β細胞特征相關(guān)的基因表達上調(diào)。這表明Ace2^low亞群可能代表未成熟的α細胞，這些細胞似乎具有β細胞樣特征。單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)進一步分析了ACE2^low α和ACE2^high α細胞HFD組和CD組之間的DEPs和富集KEGG通路。ACE2^low α細胞中下調(diào)的DEPs數(shù)量比ACE2^high α細胞多，且這些下調(diào)的DEPs富集在更多與代謝相關(guān)的通路中。這表明ACE2^low α細胞更容易受到高熱量應(yīng)激的影響，可能是一組低容量、脆弱的α細胞，而ACE2^high α細胞可能代表小鼠的主要功能細胞群，它們能夠更好地承受高熱量應(yīng)激。

 

CD81^high β細胞可能代表功能較弱的未成熟β細胞

為了分析β細胞的異質(zhì)性，研究將β細胞聚為9個簇，并鑒定出前10個標(biāo)記基因。研究發(fā)現(xiàn)CD81在β細胞簇中有差異表達，然后將9個β細胞簇分為CD81^low和CD81^high亞群。CD81^low亞群相對于CD81^high亞群，DEGs和富集的KEGG通路顯示細胞代謝通路以及一系列應(yīng)激相關(guān)的炎癥通路均顯著富集。關(guān)鍵的β細胞轉(zhuǎn)錄因子Mafa和β細胞成熟標(biāo)記物在CD81^low亞群中有高mRNA表達，而未成熟β細胞標(biāo)記物在CD81^high亞群中有高表達，這表明CD81^high亞群可能代表了一組功能弱且未成熟的β細胞。

 

為了進一步探索HFD對β細胞亞群的影響，F(xiàn)ACS顯示與CD小鼠相比，HFD小鼠中CD81^high β細胞的比例下降。在CD小鼠中檢測到869個上調(diào)和373個下調(diào)的DEPs，在HFD小鼠中檢測到707個上調(diào)和312個下調(diào)的DEPs（圖5a、b）。CD81^low亞群中與能量代謝相關(guān)的途徑都被下調(diào)（圖5 c、d）。HFD和CD β細胞的scRNA-seq中，參與這些通路的下調(diào)的DEPs也降低了，結(jié)果反映了轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的一致性。此外，在CD和HFD小鼠中，與β細胞成熟和功能維持相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PDX1在CD81^low細胞中相對于CD81^high細胞顯著上調(diào)（圖5e、f），在CD81^low細胞中，內(nèi)吞作用、吞噬體、蛋白酶體和突觸囊泡循環(huán)通路中富集的DEPs大多上調(diào)，表明CD81^low細胞處于更成熟的狀態(tài)。

圖5 β細胞亞群功能的單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定

 

HFD增強了成熟GLUT2^low δ細胞的功能

盡管Slc2a2（編碼GLUT2）是β細胞的標(biāo)志基因，但研究人員仍然在scRNA-seq中發(fā)現(xiàn)了一小群Slc2a2相對高表達的δ細胞，因此將δ細胞分為Slc2a2^low和Slc2a2^high亞群。根據(jù)Slc2a2^low亞群和Slc2a2^high亞群中的DEGs和富集通路，上調(diào)通路與鈣離子和激素分泌有關(guān)，提示Slc2a2^low亞群可能功能更成熟。來自CD和HFD小鼠的FACS分選GLUT2^low和GLUT2^high δ細胞亞群（每個樣品3,000個細胞）用于單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析，KEGG分析顯示，與β細胞相似，在CD小鼠中GLUT2^low細胞中，相對于GLUT2^high細胞，氧化磷酸化和阿爾茨海默病通路顯著下調(diào)（圖3c）。CD和HFD小鼠GLUT2^low細胞中的多種營養(yǎng)代謝途徑也顯著上調(diào)（圖3c，d）。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)途徑的內(nèi)吞作用和蛋白質(zhì)加工也是如此，表明GLUT2^low亞群的代謝更活躍。在GLUT2^low δ細胞中，比較HFD和CD小鼠，代謝相關(guān)通路、鈣信號通路、胰腺分泌、胰島素和胰高血糖素信號通路顯著上調(diào)，表明HFD促進了GLUT2^low δ細胞的能量代謝。綜上，GLUT2^low δ細胞可能比GLUT2^high δ細胞更具有功能和代謝活性，HFD進一步刺激GLUT2^low δ細胞的功能和代謝。

 

圖6 δ細胞亞群功能的單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定

 

總 結(jié)

ACE2、CD81和GLUT2作為表面標(biāo)記物分別區(qū)分成熟度和功能狀態(tài)不同的α、β和δ細胞亞群。在HFD誘導(dǎo)的葡萄糖耐受不良中，低容量和未成熟的ACE2^low α細胞比例隨著功能活躍和成熟CD81^low β細胞比例的增加而增加。成熟的GLUT2^low δ細胞功能增強，但比例不變。這些動態(tài)變化揭示了胰島在HFD應(yīng)激下的代謝可塑性，這種可塑性適應(yīng)可以通過抑制α細胞的高血糖效應(yīng)，增強β細胞的低血糖效應(yīng)，以及增加δ細胞對α和β細胞的調(diào)節(jié)來抵消代謝應(yīng)激，恢復(fù)葡萄糖穩(wěn)態(tài)。因此，靶向上述標(biāo)志物改變胰島亞群分布，以增強胰島功能可能是治療糖尿病的有效方法。

 

圖7 小鼠胰島細胞（α、β和δ）亞群在HFD誘導(dǎo)下的胰島功能紊亂

 

科技君點睛

本研究利用單細胞RNA測序技術(shù)（scRNA-seq）在HFD誘導(dǎo)的葡萄糖耐受小鼠模型中鑒定α、β和δ細胞亞群標(biāo)記物，通過流式細胞儀和免疫染色對各亞群的比例進行分類和評估，并對分選細胞進行單細胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析，通過蛋白表達深入闡明各α、β、δ細胞亞群在葡萄糖耐受不良中的功能狀態(tài)。

 

參考文獻：

[1] Control of insulin secretion by cholinergic signaling in the human pancreatic islet. Diabetes. 2014

[2] Urocortin3 mediates somatostatin-dependent negative feedback control of insulin secretion. Nat Med. 2015

[3] δ-cells and β-cells are electrically coupled and regulate α-cell activity via somatostatin. J Physiol. 2018

[4] Body-mass index and obesity in urban and rural China: findings from consecutive nationally representative surveys during 2004–18. Lancet. 2021

[5] Epidemiology and determinants of obesity in China. Lancet Diabetes Endocrinol. 2021

[6] Ethnicity-specific BMI cutoffs for obesity based on type 2 diabetes risk in England: a population-based cohort study. Lancet Diabetes Endocrinol. 2021