Cell Meter PE Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒概述
 
Cell Meter  PE-Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒是美國(guó)AAT Bioquest生產(chǎn)的用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡的試劑盒，膜聯(lián)蛋白V可以與包括PE的熒光染料結(jié)合。該染料保留了其對(duì)磷脂酰絲氨酸（PS）的高親和力，因此可用作流式細(xì)胞術(shù)分析正在經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的細(xì)胞的敏感探針。由于PS的外化發(fā)生在細(xì)胞凋亡的早期階段，PE膜聯(lián)蛋白V染色可以比基于核變化（例如DNA片段化）的測(cè)定更早地鑒定細(xì)胞凋亡。 PE膜聯(lián)蛋白V染色先于膜完整性的喪失，膜完整性伴隨由凋亡或壞死過(guò)程導(dǎo)致的最新細(xì)胞死亡階段。因此，用PE膜聯(lián)蛋白V染色通常與碘化丙啶（PI）或7-氨基 - 放線菌素（7-AAD）等活體染料結(jié)合使用，使研究者能夠鑒別早期凋亡細(xì)胞（7-AAD陰性，PE膜聯(lián)蛋白V陽(yáng)性）。具有完整膜的存活細(xì)胞排除7-AAD，而死亡和受損細(xì)胞的膜可透過(guò)7-AAD。例如，被認(rèn)為存活的細(xì)胞既是PE膜聯(lián)蛋白V也是7-AAD陰性的，而處于早期凋亡的細(xì)胞是PE膜聯(lián)蛋白V陽(yáng)性和7-AAD陰性，而處于晚期凋亡或已經(jīng)死亡的細(xì)胞都是PE膜聯(lián)蛋白V和7-AAD陽(yáng)性。該測(cè)定法不區(qū)分經(jīng)歷凋亡性死亡的細(xì)胞與因壞死性通路而死亡的細(xì)胞，因?yàn)樵谌我磺闆r下，死亡細(xì)胞都將用PE膜聯(lián)蛋白V和7-AAD染色。然而，當(dāng)隨著時(shí)間測(cè)量細(xì)胞凋亡時(shí)，可以經(jīng)常從PE膜聯(lián)蛋白V和7-AAD陰性（可行的，或不可測(cè)量的細(xì)胞凋亡）追蹤細(xì)胞至PE膜聯(lián)蛋白V陽(yáng)性和7-AAD陰性（早期凋亡，膜完整性存在），最后是PE膜聯(lián)蛋白V和7-AAD陽(yáng)性（末期凋亡和死亡）。細(xì)胞通過(guò)這三個(gè)階段的運(yùn)動(dòng)表明細(xì)胞凋亡。

Cell Meter PE Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒適用儀器  
流式細(xì)胞儀
E  x:       488nm or 561nm
E  m:       575/26nm
通道:       PE通道

Cell Meter PE Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)方案  

簡(jiǎn)要概述
（1）用測(cè)試化合物（200μL/樣品）制備細(xì)胞
（2）添加RPE-膜聯(lián)蛋白V測(cè)定溶液
（3）在室溫下孵育20-60分鐘
（4）使用FL2通道（Ex / Em = 488/585 nm）用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞

儲(chǔ)備溶液配制
除非另有說(shuō)明，否則所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分成一次性等分試樣，并在制備后儲(chǔ)存在-20°C。 避免反復(fù)凍融循環(huán)。
RPE-Annexin V原液（100X）：
將含有0.2％BSA的200μLPBS加入到RPE-膜聯(lián)蛋白V（組分A）的小瓶中以制備100X RPE-膜聯(lián)蛋白V儲(chǔ)備溶液。 注意：將重構(gòu)的100X RPE-Annexin V儲(chǔ)備溶液儲(chǔ)存在4°C。

操作步驟
A.用測(cè)試化合物處理細(xì)胞一段所需的時(shí)間（用星形孢菌素處理的Jurkat細(xì)胞4-6小時(shí)）以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。注意：膜粘附細(xì)胞的膜聯(lián)蛋白V流式細(xì)胞術(shù)分析未經(jīng)常檢測(cè)，因?yàn)樵诩?xì)胞分離或收獲期間可能發(fā)生特定的膜損傷。然而，Casiola-Rosen等人先前報(bào)道了利用膜聯(lián)蛋白V對(duì)貼壁細(xì)胞類(lèi)型進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)的方法。
B.離心細(xì)胞，得到1-5×105個(gè)細(xì)胞/管。
C.將細(xì)胞重懸于200μL測(cè)定緩沖液（組分B）中。
D.向細(xì)胞中加入2μL100XRPE-膜聯(lián)蛋白V原液。
E.可選：為壞死細(xì)胞添加2μL100XNuclear Red DCS（成分C）。
F在室溫下孵育20至60分鐘，避光。
G可選：在使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞之前，添加200至300μL的測(cè)定緩沖液（組分B）以增加體積。
H.使用具有FL2通道的流式細(xì)胞儀（Ex / Em = 488 / 585nm）監(jiān)測(cè)RPE-膜聯(lián)蛋白V的熒光強(qiáng)度。當(dāng)將Nuclear Red DCS添加到細(xì)胞中時(shí)，使用FL4通道測(cè)量細(xì)胞活力。
4.百螢 Cell Meter PE Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒數(shù)據(jù)分析
在活的非凋亡細(xì)胞中，RPE-模聯(lián)蛋白V檢測(cè)非誘導(dǎo)細(xì)胞中的先天性細(xì)胞凋亡，其通常為所以細(xì)胞的2-6%。在凋亡細(xì)胞中，RPE-模聯(lián)蛋白V與磷脂酰絲氨酸結(jié)合，磷脂酰絲氨酸位于細(xì)胞膜的外葉上，因此導(dǎo)致染色強(qiáng)度增加。


圖1.使用Cell Meter RPE-膜聯(lián)蛋白V結(jié)合細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)RPE-膜聯(lián)蛋白V對(duì)Jurkat細(xì)胞中磷脂酰絲氨酸的結(jié)合活性。 將Jurkat細(xì)胞在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中在沒(méi)有（藍(lán)色）或1μM星形孢菌素（紅色）的情況下處理4-5小時(shí)，然后用RPE-膜聯(lián)蛋白V染色30分鐘。 使用FACSCalibur（Becton Dickinson）流式細(xì)胞儀使用FL2通道測(cè)量RPE-膜聯(lián)蛋白V的熒光強(qiáng)度。

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