艾滋病是一種危害性極大的病毒性傳染病，由人免疫缺陷病毒（HIV）引起。一般來說，HIV病毒在感染黏膜組織靶細(xì)胞后兩周內(nèi)就會擴(kuò)散到淋巴器官。進(jìn)入發(fā)病期后，HIV病毒主要通過攻擊CD4+T淋巴細(xì)胞導(dǎo)致機(jī)體喪失免疫功能。感染組織微環(huán)境的原位解析能夠幫助我們更深入地理解HIV感染如何導(dǎo)致機(jī)體免疫失調(diào)，但傳統(tǒng)手段很難獲得感染組織的高參數(shù)病理結(jié)果，限制了研究的進(jìn)展。近期，斯坦福大學(xué)的Garry Nolan教授研究團(tuán)隊通過蛋白-核酸原位成像法實現(xiàn)了33種生物標(biāo)志物檢測，建立了多組學(xué)空間表型分析體系，并在《Immunity》雜志上報道了HIV宿主淋巴組織免疫抑制微環(huán)境形成機(jī)制的研究成果[1]。
 
 
研究背景
 
艾滋病又叫獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS），于1981年首次發(fā)現(xiàn)，是由于感染HIV病毒導(dǎo)致的 CD4+T淋巴細(xì)胞減少為代表特征的免疫衰竭綜合癥[2]。HIV感染后的平均潛伏期為8-10年，患者常于感染后 10-15年因并發(fā)各種機(jī)會性感染或惡性腫瘤而死亡。
 
近二十年來，抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法（ART）用于AIDS患者的治療取得了很好的效果。ART能完全抑制HIV的復(fù)制，改善免疫功能并大幅降低AIDS的病發(fā)風(fēng)險。但是，ART不能根治AIDS，臨床數(shù)據(jù)表明，停藥后病毒總是可以在幾周內(nèi)“卷土重來”[3]。體內(nèi)HIV難以清除的主要障礙就是在HIV感染的過程中，病毒能夠潛伏在某個亞群的細(xì)胞中，形成HIV潛伏病毒庫(latent reservoir)。在潛伏病毒庫中，HIV通過隱藏在被感染細(xì)胞的基因組中逃避宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，等待發(fā)病時機(jī)的到來。
 
目前，對于組織中潛伏病毒庫的研究手段多限于消化組織并進(jìn)行單細(xì)胞檢測，再輔以原位雜交（ISH）和免疫組化。這種檢測手段無法深入解讀潛伏病毒庫及周圍細(xì)胞亞群的原位空間信息，限制了其研究的發(fā)展。這篇題為“Combined protein and nucleic acid imaging reveals virus-dependent B cell and macrophage immunosuppression of tissue microenvironments”的研究中，作者利用Akoya空間單細(xì)胞蛋白組技術(shù)，實現(xiàn)了低拷貝數(shù)病毒核酸和多種蛋白標(biāo)志物的原位檢測，為我們提供了嶄新的研究視角。接下來我們就跟著作者的思路，從技術(shù)體系搭建和科學(xué)問題研究兩個方面來解讀本文的內(nèi)容。
 
 
研究過程
 
作者首先面對的關(guān)鍵技術(shù)難題就是：如何能在同一張組織切片上同時檢測蛋白表位和微弱的病毒核酸（vDNA和vRNA）信號？研究選用了非人靈長類動物疾病模型，分別利用猿猴免疫缺陷病毒（SIV）和新冠病毒（SARS-CoV-2）進(jìn)行vDNA和vRNA造模。將核酸原位雜交技術(shù)（DNA/RNA Scope）與該課題組常用的幾種蛋白原位檢測技術(shù)（IF、Akoya的PhenoImager HT(原Vectra Polaris）、Akoya的空間單細(xì)胞蛋白組PhenoCycler（原CODEX)、MIBI）技術(shù)相結(jié)合，在細(xì)胞系（圖1B）和組織切片（圖1D和E）中實現(xiàn)了蛋白-核酸原位成像（簡稱PANINI）。值得一提的是，在實驗體系優(yōu)化過程中，作者利用pH9抗原修復(fù)液有效保留樣本ISH敏感性的特點，突破了傳統(tǒng)方法樣本制備的技術(shù)壁壘。成功實現(xiàn)了一個樣本中31種蛋白和2種核酸（對vRNA和vDNA單拷貝級別精度）的檢測。
   
接下來，作者在超多標(biāo)蛋白-核酸原位成像的基礎(chǔ)上對樣本進(jìn)行空間表型分析，對比SIV感染組和對照組恒河猴淋巴組織中的細(xì)胞表型差異。33種標(biāo)志物中包含：結(jié)構(gòu)標(biāo)志物（dsDNA，Histone H3，Pan-Keratin，SMA和Vimentin），核內(nèi)功能標(biāo)志物（FoxO1，F(xiàn)oxP3，Ki-67，Lamin AC，NF-κB-p100和Pax-5），細(xì)胞質(zhì)內(nèi)標(biāo)志物（IL-10，granzyme B和CD25），髓系細(xì)胞功能標(biāo)志物（CD11b，CD16，CD68，CD163和 DC-SIGN），免疫細(xì)胞分群標(biāo)志物（CD21、CD36、CD45、CD56、CD138、HLA-DR 和 MPO），以及標(biāo)記感染細(xì)胞的vDNA 和 vRNA。根據(jù)免疫細(xì)胞標(biāo)志，作者得到樣本中14種細(xì)胞表型的分析結(jié)果（圖2）。
   
在對14種細(xì)胞亞群逐一分析的過程中，作者發(fā)現(xiàn)通過FOV細(xì)胞表型分析無法歸納出病毒感染之后免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)規(guī)律。
 
該空間單細(xì)胞表型分析出場了！
 
作者的應(yīng)對策略是采用細(xì)胞鄰域（Cellular Neighborhood，CN）分析，不僅關(guān)注細(xì)胞本身，還關(guān)注該細(xì)胞周圍的19個細(xì)胞（共20個細(xì)胞，圖3A），并對得到的信息加以k-means聚類分析（不考慮感染指標(biāo)，圖3B），進(jìn)而得到了11個有著獨特細(xì)胞分布特征的細(xì)胞鄰域（CN，圖3B）。在CN分類完成的基礎(chǔ)上，分析SIV感染導(dǎo)致的CN分布改變以及其中細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)。這種細(xì)胞群體追蹤的方法讓作者找到了多個SIV感染后的微環(huán)境變化規(guī)律。在SIV感染導(dǎo)致的眾多CN變化中，作者發(fā)現(xiàn)病毒感染導(dǎo)致CN8（富含巨噬細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞）取代CN3（富含巨噬細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞）占據(jù)主導(dǎo)地位，同時巨噬細(xì)胞免疫抑制功能相關(guān)標(biāo)志物（DC-SIGN，F(xiàn)oxO1，IL-10和CD169）陽性的細(xì)胞比例顯著升高。
   
接下來作者做了詳細(xì)的細(xì)胞-細(xì)胞分析以及CN-CN分析，對比SIV感染后組織重塑情況（圖4），進(jìn)一步將關(guān)注點鎖定在富含B細(xì)胞的CN2和富含巨噬細(xì)胞的CN8上。至此，作者已經(jīng)找出SIV感染事件中導(dǎo)致免疫失調(diào)的關(guān)鍵細(xì)胞：病毒依賴性B細(xì)胞和免疫抑制型巨噬細(xì)胞（詳細(xì)過程見原文）。
   
在隨后的功能性分析中，作者發(fā)現(xiàn)CN2中的B細(xì)胞和CN8中的巨噬細(xì)胞中IL-10陽性細(xì)胞比例顯著升高（圖5A）。一系列巧妙的實驗設(shè)計和檢測結(jié)果表明：SIV感染激活B細(xì)胞中FoxO1的表達(dá)，產(chǎn)生IL-10促進(jìn)了巨噬細(xì)胞的M2型活化，進(jìn)而形成免疫抑制微環(huán)境。
   
最后，作者還用蛋白-核酸原位成像技術(shù)進(jìn)行了SIV病毒感染后組織特性的分析，找出了感染過程中幾個關(guān)鍵的標(biāo)志物（CD56，IL-10，F(xiàn)oxO1，HLA-DR，CD21等）并提出了相應(yīng)的原位多組學(xué)空間表型分析模型。不得不承認(rèn)，這篇文章可謂是空間表型分析在艾滋病研究中應(yīng)用的杰出典范。
 
Akoya空間單細(xì)胞蛋白組學(xué)PhenoCycler
華盈生物提供服務(wù)的Akoya空間單細(xì)胞蛋白組學(xué)PhenoCycle（原CODEX）技術(shù)平臺，采用專利的DNA偶聯(lián)抗體檢測技術(shù)結(jié)合自動化高分辨熒光顯微鏡，可還原蛋白質(zhì)和特定細(xì)胞在組織中的真實分布�？蓪崿F(xiàn)近百種蛋白質(zhì)的空間原位檢測。
 
技術(shù)優(yōu)勢：
● 分辨率高，精確到0.251μm。
● 相比IMC，可實現(xiàn)全片掃描，無需預(yù)先限定感興趣區(qū)域（ROI）。
● >70種已驗證的DNA偶聯(lián)抗體可供自由選擇組合。
● 定制化更加靈活，可與商品化panel聯(lián)合使用。
 
相關(guān)文獻(xiàn)
1.Jiang S, Chan CN, X Rovira-Clavé, et al. Combined protein and nucleic acid imaging reveals virus-dependent B cell and macrophage immunosuppression of tissue microenvironments. 2022, Immunity 55, 1118–1134
2.JUNPO Hiv/Aids. 2006 Report on the Global AIDS Epidemic. Geneva Switzerland Unaids Jun, 2004, 27(7):553-556.
3.Deeks, S., Overbaugh, J., Phillips, A. et al. HIV infection. 2015, Nat Rev Dis Primers 1, 15035.
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