原代微血管內皮細胞的分離培養(yǎng)
微血管內皮細胞生長因子的應用和免疫磁珠技術的發(fā)展，使微血管內皮細胞的培養(yǎng)和純化變得相對簡化。
一、微血管內皮細胞培養(yǎng)簡述
人體主要器官和組織的微血管內皮細胞已經培養(yǎng)成功的有：骨骼肌、心、腦、胃、視網膜、肺、皮膚、脈絡膜、小腸、脂肪、肝竇、腎、關節(jié)滑膜、胎盤、骨髓、胰島、角膜及食道等器官組織的微血管內皮細胞。
微血管內皮細胞排列在血管上，并有助于許多生物過程，例如血管生成，凝血，淋巴細胞的運輸和炎癥反應。微血管內皮細胞多種多樣，具有特定的細胞特征和功能，具體取決于它們所在的器官/組織。脂肪組織是獨一無二的，因為它具有在整個成年生活中不斷生長的能力。因此，它具有高水平的血管生成，以提供脂肪組織所需的廣泛血管化。研究表明，血管生成先于脂肪生成，這意味著微血管內皮細胞影響前脂肪細胞的增殖。同時，微血管內皮細胞生長受到脂肪細胞分泌的VEGG的刺激，表明組織發(fā)育過程中微血管內皮細胞與前脂肪細胞之間存在復雜的旁分泌關系。二、微血管內皮細胞的分離
目前分離內皮細胞的方法主要有三種，即酶消化法、機械分離法和磁珠分離法。
酶消化法：優(yōu)點是分離的細胞多、純度較高；缺點是酶對某些蛋白有破壞作用。消化后的組織懸液需要用血清終止酶活性，并將組織懸液通過200目的金屬篩去除未消化組織。機械分離法和磁珠分離法：可以避免酶對內皮細胞的損傷，缺點是其他細胞的污染可能性較大。
磁珠分離法：利用特異的介質(表面有內皮細胞特異單克隆抗體的磁珠)從其他細胞群中分離出內皮細胞。這種方法雖然可以分離出可用于炎癥研究的微血管內皮細胞，但是分離的細胞量少。機械分離法：用于大血管內皮細胞的分離，這種方法避免了酶對內皮細胞的損傷和其他細胞的污染。
三、微血管內皮細胞的純化
（1）純化的方法：主要有利用尼龍網或不銹鋼網篩過濾細胞懸液、物理刮除法、生長特性選擇法、局部消化法、差速黏附法和免疫磁珠法等。
（2）生長特性選擇法：根據(jù)內皮細胞的生長特性加以分離，即已貼壁的組織塊，培養(yǎng)一段時間后除血細胞外，其他細胞尚未離開組織塊而微血管內皮細胞最先游出，這時立即移去組織塊，所留的大部分是血細胞和內皮細胞，血細胞經傳代1代至2代后自動消除，剩下便是微血管內皮細胞。這種方法由于避免了對細胞的機械和化學損傷，且不需特殊設備，操作簡單，較為可取。
（3）局部消化法：當不同類型的細胞群之間界限明顯時，可在目的細胞區(qū)域滴加少量的消化酶，作用一段時間后，將消化液連同細胞吸出，再離心除去消化酶或終止消化后，將細胞接種于另外的培養(yǎng)板孔中進行培養(yǎng)。這種方法同物理刮除法一樣，要求目的細胞的相對數(shù)量要大，并且與其他細胞界限相對明顯。
（4）差速黏附法：內皮細胞較成纖維細胞貼壁牢固，用胰酶消化細胞，在倒置顯微鏡下監(jiān)視，當成纖維細胞收縮變圓脫壁時，立即用含胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，隨后輕輕吸去細胞液，大多數(shù)內皮細胞仍然保留在原培養(yǎng)板孔中。經過數(shù)次同樣的處理，成纖維細胞基本可以被除去。
四、微血管內皮細胞的鑒定
到目前為止，還沒有發(fā)現(xiàn)不同器官組織的微血管內皮細胞具有共同的特異蛋白或標志。
微血管內皮細胞的鑒定：
（1）根據(jù)器官和組織的起源，從形態(tài)、表型、生化和功能等方面進行綜合評價。
（2）微血管內皮細胞一般呈單層生長，有接觸抑制現(xiàn)象，呈典型的鋪路石狀，電鏡下可以看到Weibel-Palade小體。
（3）表面表達CD31、CD34、凝血調節(jié)蛋白、第Ⅷ因子和選擇素等，細胞可攝取低密度脂蛋白，產生前列腺素，內吞功能，結合植物血凝素，形成毛細血管樣網絡。
五、微血管內皮細胞的培養(yǎng)要點
根據(jù)微血管內皮細胞的生長特性，需要采用一些特殊的培養(yǎng)條件，并且這些培養(yǎng)條件可能因為微血管內皮細胞的起源不同而有所差異。微血管內皮細胞的培養(yǎng)一般選用基礎培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗、谷氨酰氨、內皮細胞生長因子。
