質(zhì)膜蛋白和細胞組分分離試劑盒使用說明書
質(zhì)膜蛋白和細胞組分分離試劑盒
目錄號：SM-005
描述：
質(zhì)膜和細胞組分分離提取試劑盒利用離心管柱技術可以分離出天然的膜組分，其原理是細胞/組織通過 Buffer A 致敏，然后細胞以 Z 字形路徑通過離心管柱，在這個過程中細胞膜會破裂，分離出完整的核,因此最終獲得的膜組分中不含有核膜和核蛋白污染。通過差速離心和密度離心（無需超速離心）把細胞分為：細胞核，細胞質(zhì)，細胞器及質(zhì)膜。細胞高速離心通過具有 Z 字形通路的離心管柱時細胞膜會破裂，所以本試劑盒無需勻漿。勻漿在分離細胞膜實驗中的主要問題是每次勻漿的過程中蛋白質(zhì)圖譜都會發(fā)生變化，因此導致最終質(zhì)膜的純度有顯著變化（實驗間差異）。相比而言，我們的試劑盒只要每次實驗使用同樣起始樣品量，設定固定的離心力和離心時間，即可獲得一致性更好的結果。整個操作過程在 45 分鐘內(nèi)可以完成。
應用：
本試劑盒可以從細胞或者組織樣品中快速分離天然膜組分，可應用于 SDS-PAGE，immunoblottings，ELISA，IP，膜蛋白質(zhì)結構分析，2-D，酶活性測定及其他應用。
試劑盒組份：
1. 25 ml 裂解液 A
2. 10 ml 裂解液 B
3. 50 個離心管柱
4. 50 個收集管
5. 2 根塑料研磨棒
6. 組織分離粉
儲存：
-20℃儲存
所需附加材料
1XPBS
渦旋震蕩儀
臺式離心機
重要產(chǎn)品信息
1. 仔細閱讀整個操作說明。將緩沖液 A 和緩沖液 B 完全解凍后搖勻，放置于冰上。將離心管柱和接收管套管放置于冰上預冷。
2. 離心機請調(diào)整成 RCF/xg 模式，按照離心力設置離心機，所有離心步驟都需要在 4℃室溫下或者低溫離心機中進行。
3. 研究蛋白磷酸化，磷酸酶抑制劑應在使用前加入緩沖液 A 中。蛋白酶抑制劑可以選擇添加或不添加，如添加在使用前加入緩沖液 A 中（請按照蛋白酶或磷酸酶抑制劑母液比例，例如母液是 100x，添加時按照 1：100 添加，1ml 緩沖液 A 添加 10ul 抑制劑）。
4. 推薦使用 BCA 方法測定蛋白濃度。
5. 研磨方式請按說明書操作，請勿使用液氮研磨。
膜組分分離步驟
A.總膜組分分離
1. 將離心管柱及接收管套管放置冰上預冷
2. 細胞樣品，低速離心（500-600Xg，5 分鐘）收集 1-50 x106 個細胞。接轉(zhuǎn) 3a 步驟。組織樣品，接轉(zhuǎn) 3b 步驟。（貼壁細胞樣品建議使用細胞刮刀收集，盡量不使用胰酶消化）
注意：從細胞樣品中分離質(zhì)膜組分，建議細胞量為 20-50 X 106 個細胞。
3a. 用預冷的 PBS 清洗一次細胞。去除上清，在 Buffer A 中重懸細胞（起始細胞數(shù)小于 5X 106 加入 200ul Buffer A，起始細胞數(shù)大于 5x106 加入 500ul Buffer A）。冰上孵育 5-10 分鐘。渦旋大力震蕩 10-30 秒。迅速將細胞懸液轉(zhuǎn)入離心管柱中。接轉(zhuǎn)步驟 4.
3b. 組織樣品，將新鮮組織（10-30mg）或冷凍組織（20-30mg）放置于離心管柱上。加入 200ulBuffer A，用塑料棒反復扭轉(zhuǎn)研磨組織 1 分鐘（注意：如果你的樣品是骨骼或是心肌，建議在研磨前加入 100-200mg 組織分離粉）。再加入 300ul Buffer A，用吸頭吹打幾次后，開蓋冰上孵育 5 分鐘。接轉(zhuǎn)步驟 4.
注意：存在少量的非均質(zhì)組織不會影響樣品的質(zhì)量。塑料棒可重復使用。用 75%酒精擦拭或用蒸餾水沖洗干凈。
4.蓋上蓋子，16,000Xg，離心 30 秒。（此步驟推薦使用可在 10S 內(nèi)達到離心力的臺式離心機，離心機的離心力和升速時間會影響膜組分得率）
優(yōu)化：細胞樣品建議第 4 步完成后再次重懸細胞，轉(zhuǎn)移回離心管柱中，16,000Xg 再次離心 30 秒，重復此步驟可以增加 20-30%產(chǎn)量。
5.棄去離心管柱，渦旋大力震蕩 10 秒重懸細胞。
以下步驟將細胞分為四組分：細胞核、細胞質(zhì)、細胞器和質(zhì)膜。
6.700Xg，離心 1 分鐘（沉淀是完整的細胞核）。將上清轉(zhuǎn)移到新的 1.5ml 離心管中，4℃，16000Xg離心 10-30 分鐘（延長離心時間可以增加產(chǎn)量），棄去上清（上清為胞漿組份），保存沉淀（沉淀為總膜組份包括細胞器和質(zhì)膜）。如果不需要分離質(zhì)膜做到此步驟即可，產(chǎn)量一般為 10-500ug/樣品�？蓪⒖偰そM份存儲于-70℃或者根據(jù)下游實驗選擇溶解液溶解。如果需要提取質(zhì)膜，請不要冷凍總膜組份。分離質(zhì)膜繼續(xù)第 7 步驟。
B.質(zhì)膜組分分離
7. 加入 200ul Buffer B 用吸頭反復吹打或渦旋震蕩重懸總膜組份。4℃，7800Xg，離心 5 分鐘（注意：如果最終質(zhì)膜組份中含有細胞器膜污染，此步驟離心時間可增加到 20 分鐘提高純度，第一次使用建議按照說明書操作，無需調(diào)整離心時間）。沉淀部分為細胞器。
8.小心的將上清液轉(zhuǎn)移到新的 2.0ml 離心管中，加入 1.6ml 預冷的 PBS 混勻幾次(此步 1.6ml PBS用于調(diào)整溶液密度，不可減量)。16000Xg，離心 15-30 分鐘（延長離心時間可以增加產(chǎn)量）。棄去上清液，保存沉淀（沉淀為質(zhì)膜）。產(chǎn)量一般為 10-300ug/樣品。質(zhì)膜沉淀可以根據(jù)下游實驗需求用 20-200ul 含表面活劑的緩沖液溶解。推薦使用下表中 MinuteTM 系列溶解液溶解膜組分。做等電聚焦（2D 凝膠第一維）我們建議使用：7M 尿素/2M 硫脲/2%Chaps 和 20mM DTT (使用前將 DTT加入以上混合液中)。
推薦按照下游實驗應用選擇以下蛋白溶解液溶解膜蛋白
產(chǎn)品名稱 貨號 下游實驗應用
Minute™ 變性蛋白溶解液 WA-009 SDS-PAGE 電泳，WB，胰酶消化，用生物素標記或組氨酸標記純化蛋白質(zhì)等實驗
Minute™ 非變性蛋白溶解液 WA-010 ELISA，IP，CO-IP，酶活性檢測等其他應用
Minute™ 質(zhì)譜專用蛋白溶解液 WA-011 胰酶消化及后續(xù)的質(zhì)譜分析
關于分離出的質(zhì)膜蛋白評價
許多研究人員利用 WB 對分離的膜蛋白進行純度檢測。一些常用的“胞漿內(nèi)參”不僅僅存在于胞漿。例如 actin(1),GAPDH (2) 和 tubulin (3)主要存在于胞漿但是他們也存在于質(zhì)膜中。所以在某些細胞和組織的膜蛋白中可以檢測到這些內(nèi)參的弱信號不足為奇
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