從體外擴(kuò)增能力、體內(nèi)持久性等方面提升CAR-T細(xì)胞質(zhì)量的方法介紹
CAR-T細(xì)胞療法作為一種新興的個(gè)體化腫瘤免疫治療方式，已經(jīng)顯示出巨大的治療潛力。但是商業(yè)化運(yùn)作意味著新的挑戰(zhàn)，對(duì)比傳統(tǒng)的化學(xué)藥物，“活著”的生物藥物的不確定性更大，潛在的問(wèn)題和風(fēng)險(xiǎn)更大，藥企首先就要制定出一組合理的檢測(cè)規(guī)范，以確保CAR-T產(chǎn)品的安全性和有效性。我們今天就來(lái)認(rèn)識(shí)一下該從哪些方面確保CAR-T產(chǎn)品的質(zhì)量，讓他們更好的惠及患者。
1 CAR-T細(xì)胞的體外擴(kuò)增能力
CAR-T細(xì)胞療法需要先從患者體內(nèi)獲得T淋巴細(xì)胞，然后通過(guò)體外轉(zhuǎn)基因技術(shù) transduce CAR靶向結(jié)構(gòu)域。這一過(guò)程需要在細(xì)胞培養(yǎng)體系中得到充分的擴(kuò)增，以獲得足夠的治療CAR-T細(xì)胞數(shù)量。因此，CAR-T細(xì)胞的體外擴(kuò)增能力直接決定了能否獲得滿足治療需要的細(xì)胞數(shù)量。我們可以通過(guò)多次傳代培養(yǎng)獲得的累積細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞擴(kuò)增的倍數(shù)增加(Fold increase)以及達(dá)到設(shè)定細(xì)胞數(shù)需要的培養(yǎng)時(shí)間來(lái)評(píng)估CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的體外擴(kuò)增能力【1】。這些指標(biāo)反映了CAR-T細(xì)胞的增殖和活力,是CAR-T細(xì)胞工藝開發(fā)的關(guān)鍵性能指標(biāo)之一。
Fig1：CAR-T細(xì)胞體外擴(kuò)增過(guò)程
2 CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的持久性
CAR-T細(xì)胞輸注入體內(nèi)后的存活時(shí)間和持久性也是功能的重要衡量指標(biāo)。持久存活的CAR-T細(xì)胞可以發(fā)揮更持久的腫瘤殺傷作用。我們通常通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)定期檢測(cè)外周血CAR-T細(xì)胞的數(shù)量變化來(lái)評(píng)估其在體內(nèi)的持久性。一般輸注后1-6個(gè)月甚至更長(zhǎng)時(shí)間都可持續(xù)檢出，檢出峰值一般出現(xiàn)在輸注后1-2周，峰值后的CAR-T細(xì)胞數(shù)量隨時(shí)間遞減是正常的【2】。理想的CAR-T細(xì)胞制劑應(yīng)具有至少3-6個(gè)月的體內(nèi)存活時(shí)間，這樣才可以保證達(dá)到滿意的治療效果。
3 CAR-T細(xì)胞的腫瘤靶向性能
CAR-T細(xì)胞治療的關(guān)鍵機(jī)制在于經(jīng)過(guò)改造，T淋巴細(xì)胞獲得了高親和力識(shí)別腫瘤表面特異性抗原的能力，所以CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品必須明確具備這種靶向腫瘤細(xì)胞的能力。我們可以通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)CAR-T細(xì)胞對(duì)表達(dá)靶向抗原的腫瘤細(xì)胞系的殺傷作用，來(lái)判斷其靶向性能。此外，我們還可以在患者體內(nèi)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤組織中CAR-T細(xì)胞的浸潤(rùn)情況，看其是否能高效進(jìn)入腫瘤部位發(fā)揮殺傷功能【3】，理想的CAR-T細(xì)胞應(yīng)高度富集于腫瘤處。
4 CAR-T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性
CAR-T細(xì)胞識(shí)別腫瘤并激活后，會(huì)釋放各種細(xì)胞因子和細(xì)胞毒顆粒來(lái)攻擊和殺傷腫瘤細(xì)胞。所以我們可以檢測(cè)CAR-T細(xì)胞釋放的IFN-γ、腫瘤壞死因子-α、穿孔素、顆粒酶等水平，來(lái)評(píng)價(jià)其毒殺腫瘤的細(xì)胞毒活性以及活化狀態(tài)【4】。體外我們可以通過(guò)共培養(yǎng)CAR-T細(xì)胞和靶腫瘤細(xì)胞,檢測(cè)上述細(xì)胞因子和毒素的含量。脫顆粒實(shí)驗(yàn)也可以直觀反映CAR-T細(xì)胞釋放穿孔素和顆粒酶的水平，這些都是評(píng)價(jià)CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品殺傷活性的重要指標(biāo)。
5 CAR-T細(xì)胞的記憶能力
理想的CAR-T細(xì)胞還應(yīng)具有記憶功能，也就是重復(fù)激活后能夠取得更強(qiáng)的活性，更快地響應(yīng)腫瘤信號(hào)【5】。我們可以在體外通過(guò)多次刺激CAR-T細(xì)胞，檢測(cè)其產(chǎn)生記憶效應(yīng)，如細(xì)胞因子釋放水平提高，殺傷活性增強(qiáng)。這種獲得記憶能力的CAR-T細(xì)胞輸注體內(nèi)后，可實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤更持久更強(qiáng)勁的殺傷作用。
Fig5：CAR-T細(xì)胞長(zhǎng)久持久性檢測(cè)
6 CAR-T細(xì)胞治療的安全性評(píng)價(jià)
CAR-T細(xì)胞治療的主要風(fēng)險(xiǎn)在于可能引發(fā)嚴(yán)重的細(xì)胞因子釋放綜合征。所以我們需要檢測(cè)CAR-T細(xì)胞產(chǎn)生的與CRS相關(guān)的細(xì)胞因子如IL-6、IL-10和IFN-γ的水平，評(píng)估CAR-T細(xì)胞治療可能引起CRS的風(fēng)險(xiǎn)。此外還需要監(jiān)測(cè)其它可能的毒副反應(yīng)【6】。
這些指標(biāo)可以全方位反映CAR-T細(xì)胞的關(guān)鍵性能，包括增殖能力、腫瘤靶向性、細(xì)胞毒活性、持久性和安全性等。只有同時(shí)滿足上述指標(biāo)要求的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品，才可能在臨床中發(fā)揮出真正的抗腫瘤療效。因此，開發(fā)高活性高質(zhì)量的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品，必須建立科學(xué)合理的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，掃除在發(fā)展即用型產(chǎn)品道路上的障礙，才能在未來(lái)實(shí)現(xiàn)降低成本和提高治療效果的長(zhǎng)遠(yuǎn)目標(biāo)，惠及更多亟需治療的患者。
明星產(chǎn)品推薦
CAR-T療法作為時(shí)下最熱門的明星療法，緊隨國(guó)內(nèi)第三款CAR-T產(chǎn)品獲批上市，相關(guān)CAR-T企業(yè)和平臺(tái)紛紛加速研發(fā)步伐，積極著眼于差異化布局。未來(lái)相關(guān)企業(yè)除競(jìng)逐產(chǎn)品安全性能，降本增效將勢(shì)在必行，國(guó)產(chǎn)替代也將成為產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要途徑。免疫磁珠作為CAR-T細(xì)胞制備的重要物料，在T細(xì)胞分選/激活環(huán)節(jié)扮演著相當(dāng)重要的角色。同立海源生物GMP級(jí)產(chǎn)品ActSep® CD3/CD28分選激活磁珠（貨號(hào)：GMP-TL603）集分選和激活功能于一體，高效實(shí)現(xiàn)T細(xì)胞的分選、激活和擴(kuò)增，適合于人T細(xì)胞、CAR-T等多種T細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用，并且該產(chǎn)品已完成美國(guó)FDA的DMF II型備案（備案號(hào)：038124），支持細(xì)胞藥物注冊(cè)申報(bào)。
T細(xì)胞耗竭水平
不同的磁珠添加比例下，T細(xì)胞激活培養(yǎng)14天后檢測(cè)LAG3和PD1的表達(dá)水平， ActSep®與競(jìng)品基本持平，3：1的磁珠與細(xì)胞比例下，ActSep®耗竭指標(biāo)表達(dá)更低。此外，在Day 5去除磁珠，將進(jìn)一步降低T細(xì)胞的耗竭水平。
T細(xì)胞亞型分析
檢測(cè)ActSep®分選激活后，不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)T細(xì)胞亞型的變化。Tcm占比在培養(yǎng)過(guò)程中升高，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)Teff與Tem比例有所升高。
參考文獻(xiàn)：
【1】 Levine BL, Miskin J, Wonnacott K, Keir C. Global Manufacturing of CAR T Cell Therapy. Mol Ther Methods Clin Dev. 2016 Dec 31;4:92-101.
【2】 Biasco L, Izotova N, Rivat C, Ghorashian S, Richardson R, Guvenel A, Hough R, Wynn R, Popova B, Lopes A, Pule M, Thrasher AJ, Amrolia PJ. Clonal expansion of T memory stem cells determines early anti-leukemic responses and long-term CAR T cell persistence in patients. Nat Cancer. 2021 Jun;2(6):629-642.
【3】 Watanabe Y, Tsukahara T, Murata K, Hamada S, Kubo T, Kanaseki T, Hirohashi Y, Emori M, Teramoto A, Nakatsugawa M, Yamashita T, Torigoe T. Development of CAR-T cells specifically targeting cancer stem cell antigen DNAJB8 against solid tumours. Br J Cancer. 2023 Mar;128(5):886-895. doi: 10.1038/s41416-022-02100-1. Epub 2022 Dec 16. PMID: 36526673; PMCID: PMC9977765.
【4】 Hu Q, Li H, Archibong E, Chen Q, Ruan H, Ahn S, Dukhovlinova E, Kang Y, Wen D, Dotti G, Gu Z. Inhibition of post-surgery tumour recurrence via a hydrogel releasing CAR-T cells and anti-PDL1-conjugated platelets. Nat Biomed Eng. 2021 Sep;5(9):1038-1047.
【5】 Goodman DB, Azimi CS, Kearns K, Talbot A, Garakani K, Garcia J, Patel N, Hwang B, Lee D, Park E, Vykunta VS, Shy BR, Ye CJ, Eyquem J, Marson A, Bluestone JA, Roybal KT. Pooled screening of CAR T cells identifies diverse immune signaling domains for next-generation immunotherapies. Sci Transl Med. 2022 Nov 9;14(670):eabm1463.
【6】 《CD19 CAR-T治療B-NHL毒副作用臨床管理中國(guó)專家共識(shí)（2022）》
1 CAR-T細(xì)胞的體外擴(kuò)增能力
CAR-T細(xì)胞療法需要先從患者體內(nèi)獲得T淋巴細(xì)胞，然后通過(guò)體外轉(zhuǎn)基因技術(shù) transduce CAR靶向結(jié)構(gòu)域。這一過(guò)程需要在細(xì)胞培養(yǎng)體系中得到充分的擴(kuò)增，以獲得足夠的治療CAR-T細(xì)胞數(shù)量。因此，CAR-T細(xì)胞的體外擴(kuò)增能力直接決定了能否獲得滿足治療需要的細(xì)胞數(shù)量。我們可以通過(guò)多次傳代培養(yǎng)獲得的累積細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞擴(kuò)增的倍數(shù)增加(Fold increase)以及達(dá)到設(shè)定細(xì)胞數(shù)需要的培養(yǎng)時(shí)間來(lái)評(píng)估CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的體外擴(kuò)增能力【1】。這些指標(biāo)反映了CAR-T細(xì)胞的增殖和活力,是CAR-T細(xì)胞工藝開發(fā)的關(guān)鍵性能指標(biāo)之一。
Fig1：CAR-T細(xì)胞體外擴(kuò)增過(guò)程
2 CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的持久性
CAR-T細(xì)胞輸注入體內(nèi)后的存活時(shí)間和持久性也是功能的重要衡量指標(biāo)。持久存活的CAR-T細(xì)胞可以發(fā)揮更持久的腫瘤殺傷作用。我們通常通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)定期檢測(cè)外周血CAR-T細(xì)胞的數(shù)量變化來(lái)評(píng)估其在體內(nèi)的持久性。一般輸注后1-6個(gè)月甚至更長(zhǎng)時(shí)間都可持續(xù)檢出，檢出峰值一般出現(xiàn)在輸注后1-2周，峰值后的CAR-T細(xì)胞數(shù)量隨時(shí)間遞減是正常的【2】。理想的CAR-T細(xì)胞制劑應(yīng)具有至少3-6個(gè)月的體內(nèi)存活時(shí)間，這樣才可以保證達(dá)到滿意的治療效果。
Fig2：CAR-T細(xì)胞體內(nèi)持久性相關(guān)檢測(cè)
3 CAR-T細(xì)胞的腫瘤靶向性能
CAR-T細(xì)胞治療的關(guān)鍵機(jī)制在于經(jīng)過(guò)改造，T淋巴細(xì)胞獲得了高親和力識(shí)別腫瘤表面特異性抗原的能力，所以CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品必須明確具備這種靶向腫瘤細(xì)胞的能力。我們可以通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)CAR-T細(xì)胞對(duì)表達(dá)靶向抗原的腫瘤細(xì)胞系的殺傷作用，來(lái)判斷其靶向性能。此外，我們還可以在患者體內(nèi)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤組織中CAR-T細(xì)胞的浸潤(rùn)情況，看其是否能高效進(jìn)入腫瘤部位發(fā)揮殺傷功能【3】，理想的CAR-T細(xì)胞應(yīng)高度富集于腫瘤處。
Fig3：CAR-T細(xì)胞阻抗檢測(cè)
4 CAR-T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性
CAR-T細(xì)胞識(shí)別腫瘤并激活后，會(huì)釋放各種細(xì)胞因子和細(xì)胞毒顆粒來(lái)攻擊和殺傷腫瘤細(xì)胞。所以我們可以檢測(cè)CAR-T細(xì)胞釋放的IFN-γ、腫瘤壞死因子-α、穿孔素、顆粒酶等水平，來(lái)評(píng)價(jià)其毒殺腫瘤的細(xì)胞毒活性以及活化狀態(tài)【4】。體外我們可以通過(guò)共培養(yǎng)CAR-T細(xì)胞和靶腫瘤細(xì)胞,檢測(cè)上述細(xì)胞因子和毒素的含量。脫顆粒實(shí)驗(yàn)也可以直觀反映CAR-T細(xì)胞釋放穿孔素和顆粒酶的水平，這些都是評(píng)價(jià)CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品殺傷活性的重要指標(biāo)。
Fig4：CAR-T細(xì)胞擊殺靶細(xì)胞能力檢測(cè)
5 CAR-T細(xì)胞的記憶能力
理想的CAR-T細(xì)胞還應(yīng)具有記憶功能，也就是重復(fù)激活后能夠取得更強(qiáng)的活性，更快地響應(yīng)腫瘤信號(hào)【5】。我們可以在體外通過(guò)多次刺激CAR-T細(xì)胞，檢測(cè)其產(chǎn)生記憶效應(yīng)，如細(xì)胞因子釋放水平提高，殺傷活性增強(qiáng)。這種獲得記憶能力的CAR-T細(xì)胞輸注體內(nèi)后，可實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤更持久更強(qiáng)勁的殺傷作用。
Fig5：CAR-T細(xì)胞長(zhǎng)久持久性檢測(cè)
6 CAR-T細(xì)胞治療的安全性評(píng)價(jià)
CAR-T細(xì)胞治療的主要風(fēng)險(xiǎn)在于可能引發(fā)嚴(yán)重的細(xì)胞因子釋放綜合征。所以我們需要檢測(cè)CAR-T細(xì)胞產(chǎn)生的與CRS相關(guān)的細(xì)胞因子如IL-6、IL-10和IFN-γ的水平，評(píng)估CAR-T細(xì)胞治療可能引起CRS的風(fēng)險(xiǎn)。此外還需要監(jiān)測(cè)其它可能的毒副反應(yīng)【6】。
Fig6：CAR-T細(xì)胞治療B-NHL的CRS分級(jí)
這些指標(biāo)可以全方位反映CAR-T細(xì)胞的關(guān)鍵性能，包括增殖能力、腫瘤靶向性、細(xì)胞毒活性、持久性和安全性等。只有同時(shí)滿足上述指標(biāo)要求的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品，才可能在臨床中發(fā)揮出真正的抗腫瘤療效。因此，開發(fā)高活性高質(zhì)量的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品，必須建立科學(xué)合理的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，掃除在發(fā)展即用型產(chǎn)品道路上的障礙，才能在未來(lái)實(shí)現(xiàn)降低成本和提高治療效果的長(zhǎng)遠(yuǎn)目標(biāo)，惠及更多亟需治療的患者。
明星產(chǎn)品推薦
CAR-T療法作為時(shí)下最熱門的明星療法，緊隨國(guó)內(nèi)第三款CAR-T產(chǎn)品獲批上市，相關(guān)CAR-T企業(yè)和平臺(tái)紛紛加速研發(fā)步伐，積極著眼于差異化布局。未來(lái)相關(guān)企業(yè)除競(jìng)逐產(chǎn)品安全性能，降本增效將勢(shì)在必行，國(guó)產(chǎn)替代也將成為產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要途徑。免疫磁珠作為CAR-T細(xì)胞制備的重要物料，在T細(xì)胞分選/激活環(huán)節(jié)扮演著相當(dāng)重要的角色。同立海源生物GMP級(jí)產(chǎn)品ActSep® CD3/CD28分選激活磁珠（貨號(hào)：GMP-TL603）集分選和激活功能于一體，高效實(shí)現(xiàn)T細(xì)胞的分選、激活和擴(kuò)增，適合于人T細(xì)胞、CAR-T等多種T細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用，并且該產(chǎn)品已完成美國(guó)FDA的DMF II型備案（備案號(hào)：038124），支持細(xì)胞藥物注冊(cè)申報(bào)。
T細(xì)胞耗竭水平
不同的磁珠添加比例下，T細(xì)胞激活培養(yǎng)14天后檢測(cè)LAG3和PD1的表達(dá)水平， ActSep®與競(jìng)品基本持平，3：1的磁珠與細(xì)胞比例下，ActSep®耗竭指標(biāo)表達(dá)更低。此外，在Day 5去除磁珠，將進(jìn)一步降低T細(xì)胞的耗竭水平。
T細(xì)胞亞型分析
參考文獻(xiàn)：
【1】 Levine BL, Miskin J, Wonnacott K, Keir C. Global Manufacturing of CAR T Cell Therapy. Mol Ther Methods Clin Dev. 2016 Dec 31;4:92-101.
【2】 Biasco L, Izotova N, Rivat C, Ghorashian S, Richardson R, Guvenel A, Hough R, Wynn R, Popova B, Lopes A, Pule M, Thrasher AJ, Amrolia PJ. Clonal expansion of T memory stem cells determines early anti-leukemic responses and long-term CAR T cell persistence in patients. Nat Cancer. 2021 Jun;2(6):629-642.
【3】 Watanabe Y, Tsukahara T, Murata K, Hamada S, Kubo T, Kanaseki T, Hirohashi Y, Emori M, Teramoto A, Nakatsugawa M, Yamashita T, Torigoe T. Development of CAR-T cells specifically targeting cancer stem cell antigen DNAJB8 against solid tumours. Br J Cancer. 2023 Mar;128(5):886-895. doi: 10.1038/s41416-022-02100-1. Epub 2022 Dec 16. PMID: 36526673; PMCID: PMC9977765.
【4】 Hu Q, Li H, Archibong E, Chen Q, Ruan H, Ahn S, Dukhovlinova E, Kang Y, Wen D, Dotti G, Gu Z. Inhibition of post-surgery tumour recurrence via a hydrogel releasing CAR-T cells and anti-PDL1-conjugated platelets. Nat Biomed Eng. 2021 Sep;5(9):1038-1047.
【5】 Goodman DB, Azimi CS, Kearns K, Talbot A, Garakani K, Garcia J, Patel N, Hwang B, Lee D, Park E, Vykunta VS, Shy BR, Ye CJ, Eyquem J, Marson A, Bluestone JA, Roybal KT. Pooled screening of CAR T cells identifies diverse immune signaling domains for next-generation immunotherapies. Sci Transl Med. 2022 Nov 9;14(670):eabm1463.
【6】 《CD19 CAR-T治療B-NHL毒副作用臨床管理中國(guó)專家共識(shí)（2022）》
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