染色體外環(huán)狀DNA (extracchromosomal circular DNA, eccDNA)是一種存在于細胞核內(nèi)但獨立于染色體DNA的，封閉環(huán)狀的非質粒DNA分子，存在于所有真核生物中。
 
eccDNA在腫瘤的發(fā)病機制、腫瘤異質性的演變和耐藥等方面發(fā)揮著重要作用。eccDNA在歷史上有很多名字，包括非常大型的癌癥特異性環(huán)狀染色體外DNA (ecDNA)，它攜帶致癌基因，經(jīng)常在癌細胞中擴增。eccDNA的長度從數(shù)十堿基到數(shù)百萬堿基不等。納米孔測序兼顧長讀長與短讀長測序，是eccDNA研究的理想技術。
 
本期齊碳帶您了解近期利用納米孔測序進行eccDNA檢測的相關研究。
 
 1.小eccDNA作為多種癌癥診斷和監(jiān)測的生物標志物
▲作者:
Noer JB, Hørsdal OK, Xiang X, Luo Y, Regenberg B.
▲DOI: 
10.1016/j.tig.2022.02.007.
 INFORMATION               
▲解讀
小eccDNA具有成為癌癥生物標志物的潛力。然而，在癌變過程中小eccDNA的形成機制和功能尚不清楚，同時，癌癥患者血漿中的小eccDNA譜是否代表癌組織中的小eccDNA譜仍有待闡明。
 
本研究采用基于納米孔測序平臺的新型測序工作流程，對25例癌癥患者(包括前列腺癌、肝細胞癌和結直腸癌)和獨立驗證隊列(包括7例癌癥患者血漿和14例健康人血漿)的組織和血漿中存在的小eccDNA的全長進行測序。
   
與非癌組織相比，癌組織中檢測到的小eccDNA數(shù)量和大小均顯著增加(分別為P = 0.040, P = 2.2e-16)，分布更加均勻，形成機制也不同。盡管小eccDNA在癌癥組織和配對的血漿之間具有不同的基礎特征和基因組注釋，但它們具有相似的形成機制和癌癥相關功能。來源于某些特定基因的eccDNA在組織(AUC ≥ 0.8)和血漿(AUC > 0.9)有很好的多癌種診斷價值，特別是與CEA/CA19-9水平結合時提高了對多癌種預測的準確性。來自ALK和ETV6的小eccDNA相結合具有較高的多癌診斷價值(AUC = 0.804)，可以從組織外推到血漿，在驗證隊列中顯示出較高的陽性預測值(100%)和陰性預測值(82.35%)。
本研究表明，eccDNA作為一種獨立、穩(wěn)定的環(huán)狀DNA分子，在組織和血漿中都可以作為理想的生物標志物，有潛力用于低成本的多種癌癥診斷和監(jiān)測。

 
2.eccDNA的純化、全長測序和基因組來源定位
▲作者:
Luo X, Zhang L, Cui J, An Q, Li H, Zhang Z, Sun G, Huang W, Li Y, Li C, Jia W, Zou L, Zhao G, Xiao F.
▲DOI: 
10.1002/ctm2.1393.
INFORMATION
▲解讀
染色體外環(huán)狀DNA (eccDNA)是半個多世紀前發(fā)現(xiàn)的。然而，對其生物發(fā)生和功能的研究才剛剛開始。阻礙eccDNA研究的主要障礙之一是很難從細胞中獲得純的eccDNA。目前的eccDNA純化方法主要依賴于堿法裂解得到粗環(huán)狀DNA后，用核酸外切酶去除線性DNA。然而由于eccDNA的豐度低，尺寸不均勻，目前的純化方法無法獲得純凈的eccDNA。
本研究描述了一個新的三步eccDNA純化(3SEP)程序，增加了一個步驟以特異性的恢復環(huán)狀DNA，同時不恢復外切酶未能消化的線性DNA，因此3SEP可以進行高純度和可重復性的eccDNA制備。此外，研究者還開發(fā)了一種將滾環(huán)擴增與納米孔測序相結合的全長eccDNA測序技術，并相應的開發(fā)了一種全長eccDNA的調(diào)用算法(Flec)用于識別包含在滾環(huán)擴增產(chǎn)物中的多個串聯(lián)eccDNA拷貝的共識序列，并將其映射到基因組相應位置。該方案預計未來將促進eccDNA的鑒定和表征，且具有診斷和臨床應用的潛力。
對于熟練的分子生物學家來說，純化eccDNA大約需要 1-2天，納米孔文庫制備和測序需要5-6天，經(jīng)驗豐富的生物信息學家分析數(shù)據(jù)需要1-5天。
本研究中使用的納米孔測序方法主要用于鑒定小于10kb的eccDNA。
      3.逆轉錄轉座子劫持alt-EJ用于DNA復制和eccDNA生物發(fā)生
▲作者:
Wang Y, Wang M, Zhang Y.
▲DOI: 
10.1038/s41596-022-00783-7
INFORMATION    
▲解讀
逆轉錄轉座子（Retrotransposons）在動物基因組中高度富集。逆轉錄轉座子的激活可以改寫宿主DNA信息，從根本上影響宿主生物學。雖然逆轉錄轉座子的發(fā)育激活可以為宿主提供益處，例如對抗病毒感染，但不受控制的激活會促進疾病或潛在地推動衰老。激活后，逆轉錄轉座子利用它們的mRNA作為模板合成雙鏈DNA，在宿主基因組中插入新的片段。盡管它們編碼的逆轉錄酶可以合成第一鏈DNA，但第二鏈DNA是如何產(chǎn)生的仍不清楚。
本研究報道了逆轉錄轉座子劫持宿主的選擇性末端連接(alt-EJ) DNA修復過程，以環(huán)化步驟合成其第二鏈DNA。研究使用納米孔測序來檢測逆轉錄轉座子DNA復制的命運，發(fā)現(xiàn)其中10%實現(xiàn)了新的插入，而90%以染色體外環(huán)狀DNA (eccDNA)的形式存在。將eccDNA的產(chǎn)生作為標示，研究者們通過進一步的遺傳篩選確定了來自alt-EJ的因子對逆轉錄轉座子復制至關重要。alt-EJ通過環(huán)化過程驅動長末端重復反轉錄轉座子DNA的第二鏈合成，因此對于eccDNA的產(chǎn)生和新的插入是必要的。
該研究表明，alt-EJ在驅動基因組寄生逆轉錄元件的增殖中是必不可少的。研究揭示了這個還未被充分研究的DNA修復過程的一個保守功能，并提供了一個新的視角來理解和潛在地控制逆轉錄轉座子的生命周期。  
參考文獻：
[1] Noer JB, Hørsdal OK, Xiang X, Luo Y, Regenberg B. Extrachromosomal circular DNA in cancer: history, current knowledge, and methods. Trends Genet. 2022;38(7):766-781.
[2] Luo X, Zhang L, Cui J, et al. Small extrachromosomal circular DNAs as biomarkers for multi-cancer diagnosis and monitoring. Clin Transl Med. 2023;13(9):e1393.
[3] Wang Y, Wang M, Zhang Y. Purification, full-length sequencing and genomic origin mapping of eccDNA. Nat Protoc. 2023;18(3):683-699.
[4] Yang F, Su W, Chung OW, et al. Retrotransposons hijack alt-EJ for DNA replication and eccDNA biogenesis. Nature. 2023;620(7972):218-225.

2021年12月，齊碳科技通過5年的自主研發(fā)，成功推出國內(nèi)首臺商業(yè)化的納米孔基因測序儀QNome-3841，并宣布首個生產(chǎn)基地竣工，正式開啟納米孔基因測序國產(chǎn)化時代。2022年6月，齊碳科技發(fā)布納米孔基因測序儀QNome-3841hex，標志著國產(chǎn)納米孔基因測序儀開始了矩陣化發(fā)展，這也為靈活測序場景提供全新的解決方案，將更好地滿足市場應用的多元需求。
 
2023年8月，齊碳隆重推出自主研發(fā)的中通量納米孔基因測序平臺QPursue，該平臺涵蓋納米孔基因測序儀QPursue-6k和QPursue-6khex及其配套芯片QCell-6k，代表著國內(nèi)納米孔基因測序技術的最前沿水平，標志著國產(chǎn)納米孔基因測序儀向中高通量進階。