研究結(jié)果
1. NKO 小鼠免受飲食引起的肥胖
NKO小鼠和WT野生型小鼠都接受HFD和SCD（標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照飲食）喂養(yǎng)，SCD喂養(yǎng)組中沒有體重差異，而與WT小鼠相比，HFD喂養(yǎng)的NKO小鼠體重明顯減少（圖1A、1B）。CT掃描進(jìn)行的身體成分分析也表明，NKO小鼠的脂肪量較少，SCD喂養(yǎng)的內(nèi)臟脂肪和和HFD喂養(yǎng)的內(nèi)臟脂肪、皮下脂肪均減少（圖1C、1D）。為了更好地了解肥胖減少的原因，研究人員對(duì)僅接觸HFD 6 周（體重出現(xiàn)差異之前）的小鼠進(jìn)行了全身能量代謝研究。不同基因型之間的食物攝入量和運(yùn)動(dòng)活動(dòng)沒有差異（圖 1E、1F）。在HFD喂養(yǎng)條件下，NKO小鼠的總耗氧量明顯高于WT幼崽(圖1G、1H)，呼吸交換比(RER)降低(圖1I、1J)，表明脂肪酸被用作優(yōu)先的能量底物。此外，NKO小鼠在HFD喂養(yǎng)期間計(jì)算的每日能量消耗也增加(圖1K和1L)。
 

2. NKO小鼠具有更高的葡萄糖耐受性和胰島素敏感性
對(duì)葡萄糖的穩(wěn)態(tài)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，在HFD喂養(yǎng)6周后，在兩組之間的體重沒有差異的情況下，NKO小鼠表現(xiàn)出更好的葡萄糖和胰島素耐受能力（圖2A- 2D）。NKO小鼠的 HOMA-IR 值（胰島素抵抗指標(biāo)）也較低（圖2E）。此外，還評(píng)估了肝臟中的胰島素信號(hào)傳導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)NKO小鼠中胰島素誘導(dǎo)的AKT磷酸化比WT小鼠更明顯增加，但mTOR/S6K磷酸化沒有相應(yīng)增加（圖2F、2G） 。
 

3. NKO小鼠不受HFD誘導(dǎo)的肝脂肪變性
對(duì)小鼠的血清和肝臟脂質(zhì)代謝測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HFD喂養(yǎng)條件下NKO小鼠血清游離脂肪酸 (FFA)水平顯著低于WT小鼠。但是，血清甘油三酯（TG）和膽固醇水平?jīng)]有顯著差異（圖3A-3C）。值得注意的是，肉眼觀察、油紅O染色和肝脂質(zhì)定量顯示，HFD條件下，NKO小鼠的肝臟脂肪變性較少，肝臟中TG的積累減少（圖3D-3E、3H）。肝臟游離脂肪酸和膽固醇含量無(wú)明顯變化（圖3F、3G）。此外，NKO小鼠的ALT水平顯著降低（圖3I）。但是，通過 F4/80 或 c-caspase3 染色的組織學(xué)分析，沒有觀察到肝臟炎癥和細(xì)胞凋亡的差異（圖3J 、3K）。
 

4. 小鼠肝臟RNA-Seq和代謝組學(xué)
為了深入了解 NKO對(duì)肝脂肪變性保護(hù)作用的分子過程，對(duì)HFD喂養(yǎng)的WT和NKO小鼠進(jìn)行mRNA-seq測(cè)序，分析得到403個(gè)下調(diào)基因，304個(gè)上調(diào)基因。脂質(zhì)代謝通路在NKO肝臟中顯富集（圖 4A 和 4B）。由于NKO肝臟中TG和FFA沉積減少，重點(diǎn)研究了與脂肪酸和甘油脂代謝相關(guān)的基因表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)參與脂肪形成的基因（AcacB、FASN、SCD1、Elovl6）在NKO肝臟中都比WT組下調(diào)(圖4C)。QPCR證實(shí)了這一結(jié)果（圖 4D）。然而，與FA攝�。–D36、Fabp1、Fatp2）、FA氧化(CPT1a、Acox1、Cyp4a10)以及炎癥(Tnf-α, Il1-β, and Il-6)相關(guān)的基因在兩組中的表達(dá)沒有差異（圖4E）。但Nron缺失既不影響p65的磷酸化，也不影響炎癥基因的表達(dá)（圖4D）。相比之下，觀察到NKO肝臟中 AMPK的激活增加，SREBP-1靶基因FASN 和SCD1 的蛋白質(zhì)水平持續(xù)下降（圖 4F）。另外，觀察到HFD喂養(yǎng)的NKO小鼠肝臟中的中鏈和長(zhǎng)鏈酰基肉堿顯著減少（圖 4G)，血清β-羥基丁酸的增加也明顯改善了FAO（圖4H）。QPCR結(jié)果顯示，與 WT 小鼠相比，NKO 小鼠肝臟中的Fgf21有所增加（圖 4I）。HFD 喂養(yǎng)期間，兩組的血清中FGF21表達(dá)逐漸增加，但在NKO小鼠中FGF21水平在在整個(gè)16 周HFD喂養(yǎng)期間維持在較高水平（圖 4J），相反，在基礎(chǔ)條件下，WT 和 NKO 小鼠的脂聯(lián)素和瘦素血清水平?jīng)]有差異。本研究中，證明 NKO 小鼠肝臟中的 FGF21 蛋白水平肯定升高，而脂肪組織中的FGF21蛋白水平?jīng)]有變化（圖 4K）。為了測(cè)試這些效應(yīng)是否是細(xì)胞自主的，從 WT 和 NKO 肝臟中分離出原代肝細(xì)胞，NKO 肝細(xì)胞中FGF21 的蛋白水平隨著 AMPK 激活和 SREBP-1/FASN抑制而升高，但當(dāng)FGF21 被敲低時(shí)，這種影響被消除（圖4L）。同樣，油紅O染色和TG定量顯示，F(xiàn)GF21敲低完全消除了Nron缺失對(duì)培養(yǎng)肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積的保護(hù)作用(圖4M和N)。
 

5. Nron與KPNB1相互作用調(diào)節(jié)PER2/Rev-Erbα/FGF21
據(jù)報(bào)道，Nron 與幾種不同的蛋白質(zhì)成分相互作用，這些蛋白質(zhì)成分參與翻譯后修飾和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，或參與蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)和核質(zhì)運(yùn)輸，或充當(dāng)支架蛋白（圖 5A）。作者首先通過功能缺失實(shí)驗(yàn)研究了這些蛋白在FGF21表達(dá)中的作用，發(fā)現(xiàn)NKO細(xì)胞中FGF21的誘導(dǎo)被KPNB1敲低所抵消(圖5B)。此外，Nron與KPNB1的相互作用通過RNA Pull-down（圖5C）和RNA免疫沉淀測(cè)定（圖5D）進(jìn)行了驗(yàn)證。幾個(gè)核心生物鐘基因（Per1、Per2、Rev-Erbα）在NKO小鼠的肝臟中下調(diào)，QPCR驗(yàn)證結(jié)果一致（圖5E）。接下來(lái)用肝臟原代細(xì)胞確定了晝夜節(jié)律成分的蛋白質(zhì)水平（圖5G）。用免疫熒光測(cè)定證實(shí)了NKO 肝細(xì)胞中PER2的顯著核定位（圖5H）。此外，研究還發(fā)現(xiàn)在免疫共沉淀分析中PER2與KPNB1相互作用，并且這種相互作用在NKO肝細(xì)胞中顯著增加（圖5I）。相反，Period家族的另一個(gè)成員PER1不與KPNB1 結(jié)合（圖5J）。相應(yīng)地，KPNB1的敲低完全逆轉(zhuǎn)NKO肝細(xì)胞中PER2增加的核積累（圖5K）。PER2的敲低消除了NKO肝細(xì)胞中FGF21的誘導(dǎo)，并且Rev-Erbα的聯(lián)合敲低恢復(fù)了FGF21水平，而Nron OE減少了FGF21的表達(dá)，并且Rev-Erbα敲低完全逆轉(zhuǎn)了抑制（圖5L、5M）。Fgf21熒光素酶報(bào)告結(jié)果顯示，與WT組相比，NKO細(xì)胞的熒光素酶活性顯著增加(圖5N)。根據(jù)研究結(jié)果，作者認(rèn)為Nron通過KPNB1/PER2/REV-Erbα軸調(diào)節(jié)FGF21的表達(dá)。接著，還檢測(cè)了Nron對(duì)核心clock基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)Nron缺乏并不影響clock和Bmal的節(jié)律性(圖50)，這與的RNAseq結(jié)果一致。
 

6. Nron缺失可通過FGF21減輕肝臟脂肪變性
為了確定NKO小鼠的表型可能是FGF21誘導(dǎo)肝臟的結(jié)果，制備了攜帶FGF21 shRNA的AAV8(AAV8-shFGF21)，然后將其靜脈注射到WT和NKO小鼠體內(nèi)，以誘導(dǎo)肝臟中FGF21的敲除（KD）。KD肝臟中FGF21的含量降低了70%以上(圖6A)。值得注意的是，即使在FGF21被敲除的情況下，接受HFD喂養(yǎng)的NKO小鼠的體重和脂肪質(zhì)量也低于WT小鼠(圖6B、6C)。然而，NAFLD的改善完全減弱(圖6D-6I)，表明FGF21依賴對(duì)肝臟脂肪變性的保護(hù)作用。同樣的，當(dāng)FGF21被擊倒時(shí)，NKO小鼠AMPK的激活和對(duì)脂肪生成的抑制完全被取消(圖6J和L)。
 

7. Nron缺失促進(jìn)脂肪細(xì)胞脂解
為了更清楚地闡明Nron對(duì)能量代謝的作用機(jī)制，對(duì)脂肪組織進(jìn)行研究，組織學(xué)分析和細(xì)胞大小定量顯示，HFD喂養(yǎng)的NKO小鼠的表皮脂肪細(xì)胞比對(duì)照組小(圖7A-7C)，NKO小鼠的脂肪組織巨噬細(xì)胞和冠狀結(jié)構(gòu)的數(shù)量少于WT小鼠(圖7A、7D)。此外，對(duì)EPWAT中代謝中間產(chǎn)物的分析顯示，NKO小鼠中與三羧酸(TCA)循環(huán)相關(guān)的代謝物急劇增加，包括終末代謝物琥珀酸和富馬酸，此外，還觀察到環(huán)腺苷一磷酸(cAMP)水平升高(圖7E和7F)。接著使用p-(Ser/Thr) PKA底物抗體來(lái)檢測(cè)脂肪PKA底物，并證明在NKO小鼠的epiWAT中PKA活性確實(shí)增強(qiáng)（圖7G）。NKO 和 WT 外植體之間的基礎(chǔ)甘油和FFA釋放沒有差異，但NKO小鼠的epiWAT中ISO刺激的甘油和 FFA 釋放顯著增加。相反，胰島素對(duì)脂肪分解的抑制作用不受影響（圖7I、7J）。從NKO和 WT小鼠中分離出附睪SVF，并刺激其分化為脂肪細(xì)胞，然后進(jìn)行脂肪分解測(cè)定。Nron 敲除不影響脂肪分化（圖7K 和L）。在分化的NKO脂肪細(xì)胞中，ISO刺激的甘油和FFA釋放仍然增加（圖7M和N），同時(shí)伴隨著PKA活性和HSL磷酸化的增強(qiáng)（圖7O），表明 Nron 具有脂肪分解的細(xì)胞自主功能。當(dāng) FGF21 被敲低時(shí)，在NKO小鼠中觀察到的脂肪分解增加被保留（圖7P）。相比之下，盡管血清FGF21水平與對(duì)照組相比顯著增加，LiNKO小鼠沒有表現(xiàn)出脂肪分解改變（圖7Q）。
 

8、Nron 缺失增加脂肪組織中的脂質(zhì)周轉(zhuǎn)
使用HFD喂養(yǎng)的WT和NKO小鼠進(jìn)一步進(jìn)行EpiWAT的微陣列轉(zhuǎn)錄組分析。KEGG通路分析結(jié)果表明脂質(zhì)和碳水化合物代謝通路顯著富集（圖8A-8D），并通過QPCR對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證（圖8E和F）。并發(fā)現(xiàn)上調(diào)的基因主要與FA合成(Acc1、Acsl1、Fasn、Scd1和Elovl6)、甘油三酯合成(Gpd1、Gpd2、Dgat1)、檸檬酸-丙酮酸循環(huán)(Acly、Me1)和TCA循環(huán)(Pdha1、Pdhb、Dlat、Cs、Aco1)相關(guān)（圖8G），另外PCX和GPD1在NKO小鼠中顯著上調(diào)(圖8E-G)，G3P/DHAP比率顯著增加(圖8H)、有氧能力的指標(biāo)檸檬酸合成酶(CS)的活性也增加(圖8I)。為了進(jìn)一步評(píng)估脂肪組織的耗氧量，對(duì)飼喂高脂飼料6周的小鼠的WAT外植體進(jìn)行了細(xì)胞外流量分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NKO小鼠的脂肪組織顯示出比WT小鼠顯著更高的耗氧率(OCR)(圖8J)，表明線粒體呼吸能力增加。
 

參考文獻(xiàn)：
Please cite this article as: B. Liu, Y. Zhong, D. Huang, et al., LncRNA Nron deficiency protects mice from diet-induced adiposity and hepatic steatosis, Metabolism (2023), https://doi.org/10.1016/j.metabol.2023.155609