Simoa®單分子蛋白檢測技術由現任于哈佛大學醫(yī)學院的David Walt教授作為科學創(chuàng)始人于2007年創(chuàng)立。David Walt 是美國的工程院，藝術院和醫(yī)學院 三院院士。2010年，David Walt 將 Simoa® 技術以封面文章的形式發(fā)表在《 Nature Biotechnology》上，此技術開始為大眾所知并引起業(yè)界轟動。
 

Simoa®特點是其超高的靈敏度，較傳統(tǒng)ELISA方法能夠高出3個數量級，達到飛克級別(fg/ml)甚至更低，因此可以直接在外周血中檢測健康人群中的蛋白質生物標志物的基線表達，而不是傳統(tǒng)方法學的疾病發(fā)生后，實現探索冰山下更廣闊的蛋白檢測。
 

那Simoa技術是如何輕松實現多重檢測呢？我們來一探究竟！

Simoa單分子蛋白檢測技術工作流程

Simoa@技術是一項基于磁珠的實驗技術,磁珠直徑為2.7um,在磁珠表面,捕獲抗體會通過化學反應偶聯到磁珠上。每個磁珠表面有約250000個結合位點用于和捕獲抗體結合。結合了抗體的磁珠會和目的抗原結合,然后加入生物素標記的檢測抗體,形成雙抗夾心的免疫復合物。生物素標記的檢測抗體會進一步和親和素標記的酶結合,Simoa@使用的是半乳糖甘酶。此時,如果樣本中含有目標抗原,則磁珠會帶有酶標記,而不含有目的抗原的磁珠則保持無標記物。
 

接下來,系統(tǒng)會洗滌磁珠以除去任何非特異性結合的蛋白質。然后加入酶反應底物,Simoa@技術的真正關鍵之處就在于此時含有免疫復合物的磁珠轉移到Simoa@光盤上每個光盤有24個芯片(Array),而單個Array表面有239000個小孔(wel),每個小孔的直徑是4.25um,剛好一個磁珠落入一個小孔,小孔的反應體系是50飛升,基于磁力的作用磁珠會迅速沉入小孔中,然后系統(tǒng)會在Array表面推一層油,通過這一層油一方面將部分多余的磁珠去除,另一方面將熒光信號很好地密封在小孔中(不易信號擴散和交叉反應)。
 

由于50飛升的反應體系極小,比傳統(tǒng)100ul的體系小了20億倍,此時即使一個的目的蛋白分子其催化底物產生可以產生約3000個熒光分子,被儀器的CCD攝像頭捕獲并進行數字化成像分析。所以Simoa@僅需要一個蛋白分子就可以達到檢測底限,幾乎沒有信號的稀釋(Diffusion defeated),實現單分子的檢測。

Simoa 與傳統(tǒng) ELISA 的區(qū)別

Simoa® 單分子蛋白檢測技術「多重檢測」原理

Simoa實現多重檢測，主要是基于磁珠可以包被不同的熒光的染料。在單重檢測的時候，磁珠包被的染料在LED激發(fā)后發(fā)出綠色熒光，主要通過488通道可以實現落孔磁珠的檢測。
 

在進行多重檢測時，整個檢測流程不變，但事先會給磁珠包被不用的染料（如下圖所示，可以包被淺紫色，深紫色和藍色），這些磁珠在LED激發(fā)后會發(fā)出不同顏色的光，比如750發(fā)出紅光，通過濾光片可以在750，700和647通道檢測到這些磁珠發(fā)出的熒光，不同染料的磁珠對應包被不同的捕獲抗體，比如淺紫色磁珠對應包被Aβ40抗體，綠色磁珠對應包被Aβ40抗體Aβ42，藍色磁珠對應包被NfL抗體, 紫色磁珠對應包被GFAP抗體，這就明確了每一種磁珠對應的檢測靶標的信息。
 

在檢測過程中，對于每個樣本孔，總計會有7張照片的拍攝。第一張是白光，主要用于拍攝每個芯片中所有的孔；第二張，是在577通道，用于檢測酶催化底物發(fā)出的黃光，同時記錄時間T0;第三張，拍攝750通道的發(fā)光情況，用于檢測多重beads信號；第四張，拍攝700通道的發(fā)光情況，用于檢測多重beads信號；第五張，拍攝通道的發(fā)光情況，用于檢測多重beads信號；第六張，與第二張通道相同，也是在577通道，用于檢測酶催化底物發(fā)出的黃光，同時記錄時間T2，和第一張間隔30秒時間，如果孔內的確有抗原，酶催化底物，在30秒內，會有熒光信號的增加，當信號增加大于一定閾值認為孔內確實有抗原；第七張，拍攝488通道的發(fā)光情況，主要用于檢測單重beads信號。通過高清攝像對7張張照片的拍攝和解讀，實現了多重目的蛋白的特異性檢測。

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