近期很多老師發(fā)圖咨詢細(xì)胞培養(yǎng)時背景的“顆粒”是不是污染，如何去除？今天這篇文章小編帶大家全面解析細(xì)胞培養(yǎng)中出現(xiàn)的“顆粒”問題。細(xì)胞培養(yǎng)中常見的“顆粒”可分為胞內(nèi)和胞外兩種，下面兩張圖可以直觀地向大家展示：

 

很多老師因為不清除這些“顆粒”的來源，害怕污染而將細(xì)胞丟棄，不僅浪費心力，還耽誤實驗進(jìn)度，接下來我們逐步分析這些“顆粒”產(chǎn)生的原因。

 

1、細(xì)菌或真菌污染

圖3  污染的細(xì)胞

 

真菌污染相對來說比較好鑒別，一般肉眼可見培養(yǎng)基上層漂浮的霉斑或顯微鏡下可見菌體，細(xì)菌的菌體相對較小，顯微鏡下呈棒狀、球狀或者桿狀，由于細(xì)菌增值產(chǎn)生酸性物質(zhì)，短期內(nèi)培養(yǎng)基變黃，渾濁，細(xì)沙狀沉淀。

 

2、細(xì)胞碎片

圖4 細(xì)胞碎片和細(xì)菌區(qū)別

 

消化不當(dāng)或者PH、滲透壓、溫度的變動可能引起細(xì)胞死亡，產(chǎn)生碎片，如何對細(xì)菌和細(xì)胞碎片辨別？有困難的老師，可以登錄愛必信官網(wǎng)-產(chǎn)品資訊處或者關(guān)注愛必信公眾號查看往期文章。

 

3、凋亡小體

圖5 程序性死亡未釋放和正在釋放的凋亡小體

 

程序性死亡細(xì)胞的核DNA在核小體連接處斷裂成核小體片段，形成濃縮的染色質(zhì)塊。隨著染色質(zhì)不斷聚集，核膜在核孔處斷裂，形成核碎片。同時由于不斷脫水，細(xì)胞質(zhì)不斷濃縮，細(xì)胞體積減小。整個細(xì)胞通過發(fā)芽、起泡等方式形成一個球形的突起，并在其根部絞窄而脫落形成一些大小不等，內(nèi)含胞質(zhì)、細(xì)胞器及核碎片的小體稱為凋亡小體。

 

4、支原體集落

 

支原體無細(xì)胞壁，直徑為0.1-0.3μm，且形態(tài)易變，極易通過除菌過濾器，單個的支原體無法顯微鏡觀察，目前已知的主要污染源是動物血清、胰酶和已污染培養(yǎng)物的氣溶膠。來源廣泛、不易過濾、難以觀察，給細(xì)胞培養(yǎng)帶來了極大隱患。單個的支原體無法從顯微鏡下觀察，支原體集落卻可以被捕捉到。

圖6 被支原體集落“附身”的細(xì)胞

 

5、黑膠蟲

 

談到黑膠蟲，大家應(yīng)該都對他神秘的“身世”有印象，目前多數(shù)黑膠蟲被鑒定為細(xì)菌，黑膠蟲最明顯的特征是運動，但是這里小編要提醒大家，支原體集落，可能也會出現(xiàn)運動的現(xiàn)象，詳細(xì)的講述可以查看往期文章。

 

 

6、血清中的物質(zhì)

 

血清反復(fù)凍融或者經(jīng)過滅活后，可能會產(chǎn)生“小黑點”，此外不要認(rèn)為會增多的一定是微生物污染，血清質(zhì)量不好，影響細(xì)胞生長，衰老細(xì)胞增多形成細(xì)胞碎片，也會呈現(xiàn)細(xì)胞長勢不佳，黑點增多的現(xiàn)象。

 

經(jīng)過分析，許多老師肯定又覺得混亂，細(xì)胞培養(yǎng)遇到“顆粒”到底如何應(yīng)對？

 

首先，如果是微生物污染，不重要或者可替代的細(xì)胞，我們都建議丟棄，并排查污染來源，被污染的試劑也要丟棄，并且對使用的儀器和環(huán)境進(jìn)行除菌，比較重要的細(xì)胞，可以用含抗生素的緩沖液清洗過后，使用含較高濃度雙抗或三抗培養(yǎng)，嘗試消除，對于支原體和黑膠蟲污染，使用相應(yīng)的支原體清除劑和黑膠蟲清除劑進(jìn)行處理。

 

其他情況我們建議優(yōu)先排查血清質(zhì)量，特別是更換血清批次的，選擇質(zhì)量好的血清也是細(xì)胞培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵所在，除非實驗特殊要求，其他情況下，不建議對血清進(jìn)行滅活處理。而細(xì)胞正常凋亡產(chǎn)生的碎片，可以低俗離心分離完整細(xì)胞和細(xì)胞碎片，參考條件為300-500rpm 3min，根據(jù)實際情況進(jìn)行調(diào)整，可以用緩沖液清洗幾次。

 

最后需要注意的是某些細(xì)胞正常培養(yǎng)過程中會出現(xiàn)一些“顆粒”物質(zhì)，屬于正�，F(xiàn)象，老師們一定要多查閱資料，熟悉培養(yǎng)細(xì)胞的特性。