聚凝胺（Polybrene），也稱海美溴銨 （Hexadimethrine Bromide），是一種多聚陽離子聚合物。聚凝胺目前廣泛用于逆轉錄病毒及慢病毒介導的基因轉染，作用機理可能是通過中和細胞表面唾液酸與病毒顆粒之間的靜電排斥從而促進吸附作用。聚凝胺也常用于哺乳動物細胞的DNA轉染實驗以增強脂質體的轉染效率。其也是一種有名的抗肝素劑（肝素拮抗劑），用來生產非特異性凝集的紅細胞。另外，由于少量的聚凝胺在自動測序分析中可以增加多肽的降解現(xiàn)象，因此聚凝胺也多用于蛋白測序。

使用方法

本品為無菌溶液，濃度為10mg/mL使用時一般按1:1000-1:2000稀釋，依細胞種類不同稀釋比例不同，具體查閱相關文獻或根據(jù)實驗室經驗來調整。

 

實驗1：病毒感染

1）重組逆轉錄病毒原液的制備：取5mL生長培養(yǎng)基加入約含單層轉染逆轉錄包裝細胞的100mm培養(yǎng)盤內。孵育24h后，吸去培養(yǎng)液并用0.45μm濾器過濾；

2）待感染細胞的培養(yǎng)：100mm培養(yǎng)盤內加入10mL完全培養(yǎng)基，細胞密度約為5×105/盤；

3）病毒感染：細胞培養(yǎng)24h后，吸去完全培養(yǎng)液。用含聚凝胺的2mL病毒上清（或將病毒原液稀釋到2mL）感染細胞，聚凝胺的終濃度為5μg-10μg/mL。37°C孵育3-6h；

4）收集病毒顆粒：加入8mL完全培養(yǎng)基。感染3天后，按照1:5的比例用選擇培養(yǎng)基裂解細胞。

 

實驗2：DNA轉染

1）完全生長培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，培養(yǎng)細胞密度約50%；

2）孵育細胞18-24h后準備DNA-培養(yǎng)基-聚凝胺混合液，按如下操作制備混合液：

✦ 添加完全培養(yǎng)基（60mm培養(yǎng)皿2mL，100mm培養(yǎng)皿3mL）37°C預熱；

✦ 添加10ng~10µg質粒輕輕混勻；

✦ 加入聚凝胺至終濃度為5μg-10μg/mL。輕輕混勻。以上每個成分需要按順序加入。

3）去除培養(yǎng)基，在細胞中加入DNA-培養(yǎng)基-聚凝胺溶液，在37°C孵育細胞6-20h。細胞培養(yǎng)的前6h內約每1.5h輕柔混勻；

4）去除DNA-培養(yǎng)基-Polybrene溶液。用DMSO shocksolution（15%DMSOin1×HBSS）輕輕蓋住細胞（60mm培養(yǎng)皿3mL，100mm培養(yǎng)皿4mL）。每次加入溶液時用手輕輕搖晃培養(yǎng)盤10s，使得液體均勻分布。然后37℃孵育細胞4min；

5）立即去除DMSO shocksolution，用完全生長培養(yǎng)基輕輕清洗細胞2次。對于60mm培養(yǎng)皿每次用5mL培養(yǎng)液清洗，100mm培養(yǎng)皿每次用10mL培養(yǎng)液清洗；

6）加入完全培養(yǎng)基到細胞中；

7）穩(wěn)定轉化：去除生長培養(yǎng)基，按照1:5的比例用選擇培養(yǎng)基裂解細胞。瞬時表達：去除生長培養(yǎng)基，加入新鮮的生長培養(yǎng)基。24-72h后收獲細胞。

 

應用案例

 

例1：聚凝胺用于慢病毒介導的基因轉染

 

在篩選穩(wěn)定表達ORF3a的多克隆THP-1細胞株實驗中，研究人員在收集慢病毒上清液后，加入8μg/mL Polybrene感染THp-1細胞。

 

參考文獻：SARS-CoV-2 ORF3a positively regulates NF-κB activity by enhancing IKKβ-NEMO interaction.Virus Research,2023.

 

例2：聚凝胺用于假病毒中和試驗

 

在銀杏酸抑制SARS-CoV-2及其變異體的機制研究中，將受試化合物與hACE2/HEK293T細胞在37℃預孵育1h，然后在每孔中加入SARS-CoV-2假病毒和6μg/mL Polybrene孵育24 h，感染后48h計算IC50。

 

參考文獻：Ginkgolic acids inhibit SARS-CoV-2 and its variants by blocking the spike protein/ACE2 interplay. International Journal of Biological Macromolecules,2023.

 

例3：聚凝胺用于篩選-D-表型紅細胞

 

在初篩選實驗中，聚凝胺按4/3梯度連續(xù)稀釋制備梯度液，以聚凝胺梯度液：IgG抗-D比例 3：2配制混合液，在96孔板中，每孔加入30μL上述混合液后，每列再依次加0~35μL LIM液（以 5μL為梯度遞增），最后加入 30μL 3%紅細胞懸液，混勻，500×g離心5min，750 rpm震蕩3min，觀察不同表型細胞結果。

 

參考文獻：趙俸涌,王中英,張玉宇等.應用聚凝胺篩選-D-表型紅細胞的研究[J].中國輸血雜志, 2021.